教你利用clustalw和blat解决接头问题问题

miRNA是一类长约22 nt的非编码小RNA。miRNA通过碱基互补配对结合到靶mRNAs 3’UTRs以调控数百个基因的表达。因此，miRNA参与几乎所有生命活动，与生物体的生长、发育、疾病、衰老和死亡息息相关，可以作为疾病诊断和检测的生物标志物。

日常数据分析中，我们经常会遇到各种来源的miRNA测序原始数据，有些测36 bp，有些测50 bp，有些测75 bp或者更长的。形形色色的reads长度，adaptor接头序列，众多测序公司来源的数据，给数据分析带来了诸多不便。其中比较常见的问题就是：接头序列是什么？

小编就曾经遇到过这个问题，问某公司：“你们测序的接头序列是什么”？答复：“保密”！小编当时就想怼他：不知道接头序列，就没法把接头去掉，不去掉接头怎么往下分析？都是一个圈子混的，保不保密我不知道吗？

今天小编就教你如何在不知道接头序列的情况下，把接头序列从原始fastq文件中扒出来，同时把read的组成结构也分析一下。

1，fastq数据格式

图1. fastq格式

Fastq格式是测序原始数据存储标准格式，存储了每条read的序列及碱基质量分数。如图1所示，每4行代表一条read。

以Read1为例：

第1行代表序列的编号，以@开头；一般包括：机器编码（A00212），run id（123），flowcell编号（H3TTTDSX3），lane号（4），flowcell上的tile编号（1101），X坐标（8919）和Y坐标（1000），其后是barcode信息，用于将多个样品拆开（demultiplex）。

第2行是read序列，一般ATCG，有时候有N。N表示荧光信号干扰无法判断到底是什么碱基。

第3行是识别码，以+开头；后边接序列标示符、描述信息等，或者干脆就是+

第4行是碱基质量分数，与read序列一一对应，即每个碱基有一个分数，表明该碱基的可信程度。由于不同型号机器出来的值不太一样，因此可以根据这些值大概判断测序仪型号。

2，miRNA read构成

通常，miRNA read有三种构成方式（如图2所示）：

A：miRNA序列后边直接连接adaptor接头序列

B：miRNA序列前面加几个碱基，后边接miRNA序列，然后连接adaptor接头序列

C：miRNA序列后边加几个碱基，然后连接adaptor接头序列

图2. miRNA read构成

3，miRNA常见接头序列

通常illumina测序的小RNA接头序列有：TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCC、AACTGTAGGCACCATCAAT、AGATCGGAAGAGCACACGTCT等，拿到原始数据后，首先可以先用这3种序列去搜下。搜到了就可以先用这些接头去预分析下，拿到去接头后的miRNA长度分布图，如果长度分布正常（在22nt）附近有峰，则表示接头序列正常去掉，这种一般是图2中的A情况。对于B和C就无能为力了。

4，Clustalw检测接头序列

4.1 fastq collapse

在完全未知的情况下，我们可以这样操作。首先，将fastq格式转成fa格式，并且对每条不同的read序列进行计数，所谓的collapse步骤。

可以使用Galaxy在线工具进行操作。https://usegalaxy.org/，搜索collapse，上传fa或者fastq文件即可，其功能是统计每条unique序列的个数

图3. read序列collapse

以小编手里的fastq文件为例，经过collapse后，前10条序列为：

图4.top 10 read

肉眼可见，中间的部分序列在每条read中都存在，可能是潜在的接头序列。

4.2 clustalw多重序列比对

使用在线clustalw多重序列比对软件来检查下我们的top10序列。一般情况下，如果实验做的没问题，个别miRNA的表达量会很高，它们可能占据了绝大部分的reads，因此我们可以利用这个大概率来进行校验。

图5. Clustalw输入top10序列

图6. 多重序列比对结果

其中星号为所有序列中都一样的碱基。可以看出，后边的星号连续排列，因此初步判断为接头序列，而星号前面一个碱基仅在test_8里边与其他的9条不一样，因此，我们也把T作为接头的一部分，于是预测的接头序列就是TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCC……，经过比较，发现与我们上面提到的接头序列一样，因此，可以完全确定接头序列是正确的。

5，blat比对验证read组成

在找到接头序列后，我们可以将接头序列及以后的碱基全去掉，这样我们就得到了可能包含miRNA的reads。

图7. 包含接头的reads

如图7所示，绿色为接头序列，其左侧为可能的miRNA序列，将这10条去接头的序列（图8），粘贴到UCSC genome browser的blat工具中，检索这些序列。

图8. 去掉接头的序列

图9. Blat提交页面

Blat结果如下：

图10. Blat结果

从图10的blat结果可以看出，我们查询的序列是26或者27 bp，其中identity为100%的序列长度跨了22或者23 bp，因此可以推测序列前或者后加了4 bp的短序列。

打开details链接（图11）查看详细比对结果，可以看出都是后边4 bp的短序列没有比对上。

                                              图11. blat详细比对情况

6，结论

因此，综合上面clustalw鉴定的接头序列，和blat鉴定的read组成，我们得出接过来：该fastq的read组成是图12的形式。Read结构分析清楚后，我们就可以按部就班地进行后续的表达、差异、靶基因等分析了。

图12. Read构成

总结：认清问题，寻找解决问题的思路，思路清晰后，就可以找软件工具进行处理。

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