Nucleofector高级电转技术应用：基因组编辑

基因组编辑

基因表达调控的方式有很多种，但不外乎在DNA水平、RNA或蛋白质水平进行调控。多数的方式仅能对基因进行高效的、瞬时的调控，这在某些应用场景下非常有优势。也可以通过质粒、转座子、病毒的随机整合或同源重组完成稳定的和可遗传的DNA修饰。但是，要实现位点特异性的整合是非常耗时且困难的。随着先进的基因组编辑工具不断被发现，位点特异性稳定修饰变得更容易实现。

在过去的十年中，锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）技术被确立为位点特异性基因组修饰的有用工具，但随着最近规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）技术的出现，它成为了另一种有效的替代方案。

通过基因组编辑靶向修饰细胞DNA为基础生物学研究、早期药物发现和新型细胞疗法（例如免疫疗法）的开发提供了强有力的工具。

CRISPR技术利用工程化核酸酶在靶基因组位置删除、插入或替换基因（Gaj et al., 2013）。Cas9核酸酶在基因组DNA中产生双链断裂，从而诱导两种可能的细胞修复过程：1.非同源末端连接（NHEJ）可导致功能基因的缺失，因为它在关闭断裂时通常伴随突变。2.如果可获得部分同源供体序列，则可通过同源依赖性修复（HDR）进行基因的插入或替换。为了在特定靶序列上进行这种修饰，核酸酶与序列特异性DNA结合，将核酸酶导向靶序列。

基因组编辑工具

如上所述，对于基因组编辑，工程化核酸酶用于在靶基因组特定位置删除，插入或替换基因。这种工程化核酸酶通常由两个元件组成：内切核酸酶DNA切割模块和序列特异性DNA结合结构域。核酸酶切割双链DNA，产生双链断裂（DSB）。DSB诱导细胞DNA修复过程。这可能会发生两种类型的修复过程，1.如果没有可用的同源供体片段-无论是相应的等位基因还是外部供体DNA-断裂的末端将被重新连接。该过程称为非同源末端连接（NHEJ），并且通常可能导致基因功能元件缺失的突变。

如果存在同源的序列，例如基因组等位基因或外源供体DNA，则可以通过同源重组修复（HDR）进行基因的插入或替换。NHEJ与HDR的频率取决于实验设置，例如细胞类型和供体量。

这些核酸酶与序列特异性DNA结合结构域的组合可以定制以识别几乎任何序列，以位点特异性的方式进行基因组编辑。

常用的位点特异性的基因组编辑工具有以下三种：

· ZFN

· TALEN

· CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9

CRISPR技术来源于细菌防御病毒入侵的途径，目前已经广泛地应用于真核生物的基因组编辑。相较于ZFN和TALEN，它更具有灵活性。

更多信息，请点击阅读原文，申请Lonza “Genome editing using nucleofector technology”。

与ZFN和TALEN相比（详见下文），基于CRISPR的基因组编辑依赖于两个独立的组件一起工作：

CRISPR-Cas9

DNA靶向部分: 所谓的靶向RNA（gRNA），通常与18-21bp的基因组DNA片段互补。

Cas9核酸酶：一旦gRNA与基因组DNA链配对，Cas9核酸酶就会切割基因组DNA，引起双链断裂。

由于DNA特异性部分是RNA分子，因此比ZF-或TALE-核酸酶融合蛋白更容易设计和生产。此外，通过将Cas9核酸酶与靶向不同位点的几种gRNA一起转移，可以进行多基因组编辑。

基于CRISPR-Cas9的细胞共转染方案

· 转入一个同时包含gRNA和Cas9核酸酶的质粒

· 共转入两个单独的质粒（一个含有gRNA，另一个包含Cas9）

· 共转一个包含Cas9的质粒和一个可以表达gRNA的PCR序列

· 体外组合的Cas9-gRNA的RNP复合物

· 如果是为了插入或替换，还需要再共转一个供体DNA质粒或一个单链核苷酸（ssODN）

Lonza独有的NucleofectorTM高级电转技术已被证明可作为基于CRISPR的基因组编辑工具的可靠转染方法

NucleofectorTM高级电转技术特点

1.广泛的细胞类型（包括iPSC）具有高转染效率

2.有效地共转染各种底物

3.使用简单，转染质粒、DNA、mRNA、PCR序列或ssODN时可采用相同的实验条件

(Ran et al., 2013) Nature Protocols出版物提供了关于使用4D NucleofectorTM系统进行CRISPR转染的非常全面的指南。

ZFN

锌指（ZF）蛋白是自然界中最丰富和最通用的DNA结合结构域(Tupler R et al., 2001)。单个锌指结构域结合3个DNA碱基对。由于它们的模块化结构，它们为设计人工序列特异性结合分子提供了理想的框架。ZF与内切核酸酶（主要是Fok1）的融合构建了锌指核酸酶（ZFN）。两种这样的ZFN组合起作用以结合靶DNA序列的有义和反义链。结合后，Fok1核酸酶形成活性二聚体并诱导双链断裂，引起随后的细胞修复过程。

Lonza的NucleofectorTM高级电转技术已经被成功的应用于ZFN的转染。更多信息，请点击阅读原文，申请Technical Reference Guide。

TALEN

2009年，科学家们发现转录激活因子样效应子（TALEs）可作为更简单的模块化DNA识别蛋白(Boch et al., 2009; Moscou et al., 2009)。TALE是来自植物病原菌属Xanthomonas天然存在的蛋白质，并且含有DNA结合重复序列，每个重复序列识别单个碱基对。与锌指的基于三联体的DNA结合相比，TALE-DNA结合重复的这种单碱基识别模式使得设计具有更大的灵活性，但也存在一些克隆挑战。同样，工程化的TALE通常与Fok1核酸酶融合以构建TALE核酸酶融合物（TALEN）。与ZFN一样，必须为每个靶标产生一对TALEN，每个单体结合(Jinek et al., 2013) 靶DNA的有义或反义链。

Lonza的NucleofectorTM高级电转技术已经被成功的应用于TALEN的转染。更多信息，请点击阅读原文，申请Technical Reference Guide。

引用文献

1.Gaj T et al. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology 31(7):397-405 (review)

2.Petit CS et al. (2013) J Cell Biol 202:1107-1122 (cells: HeLa)

3.Ran FA et al. (2013) Cell 154:1380–1389 (cells: various cell lines, e.g. HEK293FT)

4.Ran FA et al. (2013) Nat Prot 8(11):2281–2308 (cells: HEK293 and HUES62)

5.Seki and Rutz. (2018) J Exp Med 215(3):985-997

6.Tupler R et al. (2001) Nature 409: 832-833
7.Boch J et al. (2009) Science 326 (5959): 1509–12
8.Jinek M et al. (2013) eLife 2: e00471
9.Moscou MJ et al. (2009) Science 326 (5959): 1501

关于龙沙生命科学

龙沙生物科学解决方案为两个业务领域提供工具：为全球学术和产业研究机构的创新性研究提供研究和疾病发现工具，并为制药和生物制药生产提供解决方案，包括细胞治疗和病毒疗法等新兴技术。

泽平科技作为lonza的在中国的忠实伙伴，在国内代理lonza各类产品服务已达十数年，已形成完善的lonza产品系售前售后、技术服务以及数个各类成熟的解决方案，服务于中国科研、企业等用户。搜索“北京泽平”可立即进入咨询报价！

Nucleofector高级电转技术应用：基因组编辑相关推荐

基于CRISPR等基因组编辑技术的“非转基因类”农作物改造
作为农业研究领域中社会热度较高的话题,转基因作物早已进入大众视野,并且引起了一系列争议.面对转基因技术争议和农作物增产增质需求之间的矛盾,如何在改造植物性状的同时消除外源基因插入的影响是科学家们需要解 ...
CRISPR技术：基因编辑婴儿或能免受镰状细胞病和肌营养不良症困扰
全文共2490字,预计学习时长7分钟图源:cgtn CRISPR技术的出现,使得利用基因编辑治疗并预防疾病的前景变得可观.通过调整人类胚胎的基因,有可能使婴儿及后代摆脱某些遗传性疾病. 不过,国际科 ...
以“技术”规划跨境电商未来发展之路！跨境电商技术论坛顺利举办！
9月19日,电商中国·浙江杭州-第七届中国(杭州)国际电子商务博览会.2020浙江数字贸易交易会.第十一届浙江商务服务交易博览会跨境电商技术论坛峰会在杭州国际博览中心召开.此次大会以"数字赋 ...
高级Socket编程技术
高级Socket编程技术实验目的 1.了解阻塞与非阻塞模式Socket编程的工作原理. 2.了解Socket编程的5种模型的工作原理和使用方法. 3.掌握Select模型和WSAAsyncSelec ...
市场调研-基因组编辑突变检测试剂盒市场现状及未来发展趋势
根据QYR(恒州博智)的统计及预测,2021年全球基因组编辑突变检测试剂盒市场销售额达到了亿美元,预计2028年将达到亿美元,年复合增长率(CAGR)为 %(2022-2028).地区层面来看,中 ...
android平台短视频技术之视频编辑的经验分享
android平台短视频技术之视频编辑的经验分享. 提示一: 各位看官,这里分享的是视频编辑,即剪切/拼接/分离/合并/涂鸦/标记/叠加/滤镜等对视频的编辑操作.不是流媒体网络播放等功能,请注意. ...
浙江大学走进淘系技术，了解阿里淘系电商技术发展史与企业文化
2021年6月11日下午,以"科技橙就新商业"为主题,由浙江大学计算机学院和阿里巴巴淘系技术共同举办了"浙江大学走进阿里巴巴淘系技术"活动,50位浙大计算机专业 ...
实验五 oracle高级数据查询技术
实验五 oracle高级数据查询技术实验目的: 一.掌握日期型数据的操作技术二.掌握层次查询技术三.理解情景查询与翻译查询技术四.了解统计查询技术实验内容: 一.日期型数据的操作 ...
Unix网络编程(六)高级I/O技术之复用技术 select
转载:http://blog.csdn.net/michael_kong_nju/article/details/44887411 I/O复用技术本文将讨论网络编程中的高级I/O复用技术,将从下面几 ...

Nucleofector高级电转技术应用：基因组编辑

Nucleofector高级电转技术应用：基因组编辑相关推荐

最新文章

热门文章