GSEA实战分析(结直肠癌基因转录表达数据)

数据文件“COAD_normal_tumor.csv”中包含了结直肠癌基因转录表达数据(数值为比对得到的read counts)，列为样本，行为基因，其中结直肠癌表达数据为TCGA开头的样本名，正常对照样本表达数据为GTEX开头的样本名。

1.表达矩阵为什么要归一化

在RNA-seq上游分析的过程中，所得到的的产物为表达矩阵，一般指RSEM\HTseq等量化工具统计得到的，各个样本比对到参考基因组中各个基因的reads数，一般为raw read count，这是最简单的表达定量形式。

测序步骤产生大量的cDNA片段序列，称为reads，每个reads代表样品中某些RNA分子的一部分，然后我们将每个read分配到一个isoforms(isoforms可以认为是同一个基因的不同版本的蛋白质)，并计算每个isoforms有多少个reads。在其他条件都相同的条件下，isoforms越丰富，则来自该异构体的片段越可能被测序，因此我们将reads计数代表isoforms的丰度。
但光有raw read count是不够的严谨的，往往还需要归一化处理，主要解决以下问题：

目标基因的转录本长度：长度越长的转录本对应能够mapping上的reads数也越多，无法反映该基因实际的表达情况，因为RNA分子在测序之前先进行片段化，较长的转录本会比较短的转录本被剪切成更多的片段，因此转录本的reads数不仅与其表达水平成正比，而且也与长度成正比。这样序列长的基因永远会被认为表达量较高，从而错误估计基因真正的表达；
深度测序(相当于测序几遍)：测序深度用来比较细胞之间的基因表达，总的有效比对的reads数量，即去除没有mapping上的，或者匹配不准确的reads，显然测序深度越深，总的有效比对的reads数量越多，每一个基因对应mapping到的reads数量也越多；

Coverage ratio(覆盖比率 覆盖率 基因组覆盖率)：指被测序到的碱基占全基因组大小的比率。
Coverage depth(覆盖深度 测序深度 碱基平均测序深度) ：指每个碱基被测序的平均次数，即测序的数据总量比基因组大小。

测序的偏差：样品之间一些高度差异表达的基因：样品之间表达的基因数量不同或存在污染会影响某些类型的标准化方法。建议对RNA组成进行核算，以准确比较样品之间的表达，在进行差异表达分析时尤为重要。

2.常用归一化方法

管家基因定量

是指所有细胞中都要稳定表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，管家基因是一类始终保持着低水平甲基化并且一直处于活性转录状态的基因。

RPKM和FPKM

RPKM：Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的reads)。

将raw counts除以该样本总的有效的(匹配上的)reads数(以KB为单位)，以减少测序深度的影响；再除以该基因的转录本长度(以百万为单位)，即真核生物外显子长度和、原核生物编码区长度和，以减少基因长度的影响。

在single-end测序中，一个read就是一个read。而在pair-end测序中，若一对paired-read 都比对上了，当做两个read；若只有一个read比对上，另一个未比对上，当做一个read计算。

局限性：该算法除以有效比对的reads总和的这种方式，排除了测序深度对总reads数的影响，但是没有考虑到基因转录本长度对reads总和的影响，可以说RPKM是先进行测序深度标准化，后进行基因长度标准化。为了排除转录本长度对reads总和的影响，应当首先进行基因长度标准化，载根据长度标准化后的reads总和进行测序深度的标准化，TPM算法应运而生。

FPKM：Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)。

一般针对双端测序的方法。在single-end测序中，FPKM将read当做fragment计算，此时FPKM和RPKM是相同的。而在pair-end测序中，若一堆paired-read 都比对上了，当做一个fragment。

步骤

首先对总值数据进行标准化
接着将每次的read除以经标准化处理后的总的reads，这样可以得到每次所占的比重
最后在计算每千碱基下的配对到外显子的read比重

TPM

TPM：Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)。

TPM是先根据基因长度矫正count值，即用count值除以基因长度(百万为单位)得到矫正后的reads数，将所有校正后的count值相加得到矫正后的总counts值，将校正后的count值除以校正后的总count值，得到TPM值。

RPM和CPM

RPM和CPM：RPM/CPM: Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百万映射读取的reads)。

指将count数除以总有效匹配的count数，以排除测序深度的影响，常常用于长度差异不大的sRNA的分析。