代谢组学中秋特别篇：中药复肾汤治疗慢性肾衰竭机制探索

发表期刊：Frontiers in Pharmacology

影响因子：5.81

合作单位：重庆医科大学

百趣生物提供服务：中药非靶标代谢组学

1研究背景

慢性肾功能衰竭（CRF）是一种由多种原因导致肾功能进行性丧失并最终导致肾功能衰竭的疾病。近年来，CRF因其病情危重、发病率和死亡率高，已成为不可忽视的重大公共卫生问题。研究发现CRF的发病机制可能与遗传因素、血液动力学变化、炎症因子、氧化应激等密切相关。CRF的主要治疗方法是肾移植和血液透析，但疗效较差。

复肾汤（FSGD）是国医大师郭子光教授经60余年的临床创制的经验方。其作用是补肾、活血、化浊，改善肾功能和肾纤维化。本文作者课题组先前的研究表明FSGD可以显著降低α-SMA和TGF-β1的表达水平，从而减少肾纤维化。尽管FSGD在CRF中的临床应用已经得到验证，但由于其成分和靶点的复杂性，其治疗CRF的机制尚不清楚。

重庆医科大学黄学宽课题组罗洪玉在相关研究中，利用网络药理学和UHPLC-MS/MS技术，对FSGD治疗CRF的有效成分及其作用机制进行预测，并结合体内实验进一步证实PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代谢组学信号通路是FSGD治疗GRF的关键通路。

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图1. FSGD在GRF中的研究示意图

2研究设计

将雄性SD大鼠(200±20g)随机分为正常组、模型组、阳性对照组（NDQ）、FSGD组。用腺嘌呤建立CRF动物模型，然后FSGD治疗4周。收集血清和尿液样本，检测代谢生化指标以评估肾功能。通过对肾脏组织进行苏木精-伊红染色和马松染色实验来评价肾脏病理损伤程度。采用免疫组织化学和蛋白印迹分析检测蛋白的表达水平。

3研究结果

（1）FSGD的药用活性成分及相关靶点

从TCMSP数据库中检索到121个FSGD药用成分。以OB≥30%、HL≥4和DL≥0.18为筛选标准。将符合筛选标准的药用成分进行进一步分析，在FSGD中预测得到893个假定靶点。

（2）CRF靶点预测和共有靶点

从GeneCards数据库中总共获得8596个CRF 靶点。其中1115个靶点可以作为候选治疗靶点。将 FSGD 的靶点与 CRF 的靶点进行比对并绘制维恩图，发现192 个共有靶点，例如 EGFR、TNF和AKT1(图2A)。第一维共同靶点被认为是FSGD 抗CRF的潜在治疗靶点。

（3）GO和KEGG富集分析

经GO分析，发现炎症反应、凋亡信号通路和细胞外基质参与了CRF的过程(图2B)。在KEGG通路富集化分析位于前15的信号通路中，PTEN/PI3K/AKT/NF-κB参与慢性肾功能衰竭过程中细胞的凋亡与增殖、炎症和纤维化(图2C)。先前研究表明，FSGD可通过RAS系统中的ACE-Ang II-AT1R轴改善CRF大鼠的肾功能，抑制肾纤维化，而RAS与肝脏中的PI3K/AKT通路密切相关。据此，作者推测FSGD治疗CRF的机制可能是通过调节PTEN/PI3K/AKT/NF-κB信号通路。

（4）FSGD治疗GRF理论活性成分一维网络可视化

利用192个共有靶点构建PPI网络，PPI网络分析表明STAT3,PIK3CA,PIK3R1,MAPK1,SRC和AKT1是PPI网络中前六大靶基因。其中PIK3CA,PIK3R1和AKT1与PTEN/PI3K/AKT/NF-κB通路有关，AKT1是关键基因(图2D-E)

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图2. FSGD在GRF中的第一维网络药理学研究

（5）UHPLC-MS/MS检出有效成分的第二维网络药理学分析

FSGD正/负总离子流图展示了该汤剂所有化合物的化学成分，经过与中药系统药理学数据库收集的有效化合物比对出40种化合物。使用前面的筛选标准筛选出9个候选化合物，并预测了它们的靶标(图3A-C)，然后进行了第二维网络药理学分析。PPI结果表明，AKT1是该网络的最高靶基因和中心基因。此外，GO、KEGG和PPI的结果都参与了PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代谢组学通路(图4A-D)。

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图3. 超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)鉴定FSGD水提取物溶液中的化学成分

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图4. CRF中FSGD检测成分的第二维网络药理学研究

（6）FSGD对肾功能的保护作用

通过24h尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮检测肾功能。与正常组相比，模型组大鼠24h尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮均显著升高，表明本实验成功建立了CRF大鼠模型。然而，FSGD和NDQ显著降低了这些CRF指标，且FSGD组改善显著(图5A-C)。结果表明，FSGD可以改善CRF症状和肾功能。

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图5. FSGD对肾病理性损伤和肾纤维化的影响

（7）FSGD减轻肾脏病理损伤和肾纤维化

与正常组相比，模型组大鼠肾脏病理形态发生显著改变，肾小管扩张或萎缩，大量炎性细胞浸润，腺嘌呤结晶沉积阻塞管腔。同时，NDQ和FSGD可减轻上述病理损伤。经Masson染色，与对照组相比，模型组大鼠肾组织中胶原纤维显著累积，FSGD显著改善肾纤维化(图5D-E)。

（8）FSGD对慢性肾衰模型PI3K/AKT信号转导通路的影响

免疫组化检测结果发现模型组PTEN表达显著降低，而FSGD组PTEN表达显著升高(图6A-B)，表明PTEN表达主要受PI3K/AKT通路调控。免疫组化分析发现，模型组肾组织中PI3K、AKT、p-AKT表达均显著升高，FSGD和NDQ显著上调PTEN的表达，提示降低PI3K、AKT和p-AKT的表达是通过抑制 PI3K/AKT通路实现的(图6C-E)。

为了验证上述假设，作者使用蛋白印迹分析进一步检测了肾脏中的关键因子PTEN及其上游因子PI3K和p-PI3K的蛋白水平。与正常组比较，模型组大鼠PTEN表达显著降低，FSGD和NDQ治疗后PTEN表达显著增加(图7A-D)。此外，在模型组PI3K和p-PI3K的表达显著增加，而FSGD和NDQ处理组与模型组相比，PI3K和p-PI3K的表达显著降低(图7A-D)。

为了进一步揭示FSGD在PTEN/PI3K/AKT/NF-κB通路中的作用机制，作者测定了下游因子AKT、p-AKT和NF-κB，因为这些因子在肾纤维化中起着重要作用。与正常组相比，模型组肾组织中AKT、p-AKT和NF-κB的表达显著增加，表明肾组织中PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代谢组学通路被激活，而FSGD和NDQ处理后肾组织中AKT、p-AKT和NF-κB的表达显著降低(图7E-H)，说明FSGD和NDQ处理能够抑制PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代谢组学通路。

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图6. FSGD对PI3K/AKT通路的影响

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图7. PI3K/AKT通路蛋白分析

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图8. FSGD治疗CRF分子调控示意图

4总结

综上所述，作者本研究中进行系统地鉴定了FSGD中包含的成分，并通过二维网络药理学和体内实验研究了FSGD治疗CRF的分子调控机制。本研究结果表明，FSGD减轻CRF大鼠肾纤维化和肾损伤的作用可能与抑制PTEN/PI3K/AKT/NF-κB代谢组学信号通路有关。网络药理学是探索复杂疾病机制和药物多靶点的新策略，可以帮助中药研究人员更准确地找到最可能的药物治疗机制，为进一步的实验提供更充分的理论基础。

文/阿趣代谢组学

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