Cancer Cell ChIP-seq助力揭示BATF缺失可增加CAR-T细胞抗肿瘤活性的研究

发表单位：中国科学院动物研究所

发表期刊：Cancer Cell（38.585）

发表时间：2022年10月13日

研究材料：CAR-T细胞

2022年10月13日，中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室王皓毅团队在肿瘤学顶级期刊Cancer Cell杂志上发表题为“Depletion of BATF in CAR-T cells enhances antitumor activity by inducing resistance against exhaustion and formation of central memory cells ”的研究论文。该研究在体外建立了具有典型耗竭特征的人原代CAR-T细胞耗竭模型，发现BATF通过与CAR-T细胞相关基因结合，驱动T细胞衰竭并抑制中央记忆亚群的形成，BATF的消耗增强了CAR-T细胞对实体肿瘤的抗肿瘤活性。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持。

研究背景

嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗血液癌在临床应用中已显示出令人印象深刻的疗效，但其对实体肿瘤的疗效有限，其中一个主要的挑战是T细胞衰竭。为了解决这一挑战，作者使用功能低下的CAR-T细胞模型进行了候选基因筛选，发现碱性亮氨酸拉链ATF样转录因子（BATF）的消耗改善了CAR-T细胞的抗肿瘤性能。

研究思路

研究结果

1.功能低下的CAR-T细胞模型显示出衰竭特异性表型

作者选择间皮素（MSLN）作为CAR-T细胞的靶点，因为它在一些实体肿瘤中高表达，而它在正常组织中的表达有限。研究中使用的CAR（M28Z）是由来源于抗MSLN单克隆抗体P4、CD28共刺激域和来自CD3-zeta的胞内结构域的单链可变区片段（scFv）组成的。CAR-T细胞来自一个脐带血（UCB）样本（供体1）和一个外周血单个核细胞（PBMC）样本（供体2），均来自健康捐赠者。在不同的效应-靶（E:T）比例，M28Z CAR-T细胞与NCI-H226-荧光素酶细胞共培养1天后显示出强大的肿瘤裂解活性。

为了长期监测肿瘤溶解的动态，研究将共培养时间延长到8天。E:T比率低至1：1的CAR-T细胞在长时间培养后可以消除几乎所有的肿瘤细胞。相反，在更低的比例下（0.1:1），CAR-T介导的肿瘤溶解在第4天左右稳定地降低约50%（图1A），但残留的肿瘤细胞仍表达MSLN，大部分CAR-T细胞仍为CAR+。为了表征这些CAR-T细胞的状态，作者在第7天对与肿瘤细胞以0.1:1 E:T比例共培养的CAR+细胞进行了分类，称为功能低下的M28Z。与肿瘤细胞在 E:T比例=2:1（达到90%肿瘤溶解）共培养24小时后，CAR-T细胞被分选，称为活化M28Z；从低温保存的原液中解冻的CAR-T细胞作为对照（新鲜的M28Z）（图1B和C）。在遇到肿瘤细胞后，功能低下的M28Z的特异性裂解能力和细胞因子释放能力均低于活化的和新鲜的M28Z细胞（图1D和E）。

为了表征这些功能低下的CAR-T细胞，研究从三组中分离出来的CD8+细胞进行了RNA测序。为了控制长期培养对CAR-T细胞的影响，作者对单独培养7天的CAR-T细胞进行了测序（称为未受刺激的M28Z）（图1C）。衰竭相关的基因（PDCD1、HAVCR2、CTLA4和TIGIT）在功能低下的M28Z中表达最高，而激活相关基因（IFNG、IL2、TNFRSF9和GZMB）在功能低下的M28Z中的表达明显低于激活的M28Z（图1G）。

基因集富集分析（GSEA）显示从肝癌、结肠直肠癌、非小细胞性肺癌个体和经典克隆13 LCMV感染小鼠模型肿瘤样本中的CD8+ T细胞中鉴定出的衰竭相关基因在功能低下的M28Z的上调基因中显著富集（图1H）。肿瘤裂解能力、细胞因子释放能力和基因表达谱表明，功能低下的CAR-T细胞表现出严重的衰竭表型。

图1 CAR-T细胞功能减退模型显示出完全的T细胞衰竭表型

2.敲除BATF可以挽救CAR-T细胞衰竭

成功建立模型后，作者首先验证了PDCD1的功能，其在活化细胞和功能减退的细胞中表达上调。PDCD1编辑的CAR-T细胞（M28Z-PKO）在体内和体外均表现出更好的肿瘤消除能力，证实了PDCD1在T细胞衰竭发展中的关键功能。联合肝癌、结肠直肠癌、非小细胞性肺癌的衰竭T细胞数据，作者定义了一组与人类功能衰竭相关的基因（138个基因，文章表S1)，作者把这些基因作为衰竭特征基因用于后续分析。从这里选择19个基因，另外从文献中选择11个与T细胞功能相关的基因，它们在功能低下模型中表达上调。

作者在CAR-T功能低下模型中筛选这30个基因，发现敲除BATF和IRF4可获得最高的肿瘤溶解能力（图2A）。据报道，BATF和IRF4可以形成一个复合物，结合AP-1-IRF4复合元件（AICEs），共同调控多个靶基因。因此，作者选择BATF和IRF4作为抵抗CAR-T细胞衰竭的潜在靶点。

为了确定BATF和IRF4的功能，该研究做了肿瘤溶解、细胞因子释放分析以及RNA-seq分析。结果显示，虽然IRF4或BATF的消耗提高了CAR-T细胞的抗肿瘤活性，但只有BATF编辑的CAR-T细胞具有衰竭水平降低的表达谱。

图2 BATF基因敲除可改善CAR-T细胞衰竭

3.BATF编辑增强了CAR-T细胞在体内对实体肿瘤的疗效

该研究使用细胞系来源的异种移植瘤（CDX）模型在体内进一步检测M28Z-BKO和-IKO（BATF或IRF4敲除的CAR-T细胞）的抗肿瘤疗效（图3A）。与PBS组相比，静脉注射M28Z小鼠的肿瘤生长较慢（图3B和C）。M28Z-BKO组肿瘤生长控制较好，而M28Z-IKO组与M28Z组相比无显著性差异。然后，作者在这些组的肿瘤切片中检测到肿瘤浸润的CAR-T细胞，发现与M28Z组相比，M28Z-BKO组中肿瘤浸润的CAR-T细胞数量明显增加（图3D）。M28Z-BKO中IFNG和MKI67信号多于M28Z，说明BATF编辑的CAR-T细胞对实体肿瘤具有较好的疗效（图3E）。该研究还在这个CDX模型中注射CAR-T细胞。同样，M28Z-BKO的肿瘤清除效果优于M28Z。

考虑到肿瘤的异质性，作者建立了一个MSLN异质性表达的胰腺癌患者来源的异种移植模型（PDX #1）。通过鞘内注射给药CAR-T细胞，并观察到在注射M28Z-BKO后第35天，5个肿瘤中有4个被完全根除，而M28Z和M28Z-IKO组肿瘤生长仅减慢（图3G,H和E）。这些结果证实了BATF敲除提高了CAR-T细胞的体内抗肿瘤效果，而编辑IRF4没有显著效果。为了检测BATF编辑的CAR-T细胞是否具有持久的肿瘤消除能力，将同一肿瘤样本重新接种。结果显示BATF敲除的CAR-T细胞在体内具有优越和持久的抗肿瘤疗效。

图3 BATF的缺失增强了CAR-T细胞在体内对实体肿瘤的疗效

4.干扰BATF显著影响了6种CAR-T细胞和小鼠OT-1细胞的疗效

为了验证BATF在人CAR-T细胞中的功能，作者通过慢病毒转导在CAR-T细胞中超表达BATF（M28Z-BOE）。实时荧光定量PCR、FACS和western blot检测证实M28Z-BOE中BATF的表达显著升高。在功能低下模型中，M28Z-BOE的肿瘤溶解减少（图4A）。在多轮肿瘤细胞刺激后，M28Z-BOE的细胞溶解能力受损，而M28Z-BKO（敲除BATF）的细胞溶解能力与M28Z明显改善（图4B）。作者发现，随着E:T比值的降低以及肿瘤刺激的次数增加，干扰BATF对CAR-T细胞的影响更加明显（图4C,D）。这些结果表明，BATF在表现出更严重衰竭的CAR-T细胞中发挥了更重要的作用。

为了确认BATF在不同类型的衰竭CAR-T细胞中的功能，作者在不同的衰竭诱导条件下使用5种不同的CAR方案进行实验，一致发现，敲除BATF提高了CAR-T细胞的肿瘤消除能力，而过表达BATF则降低了该能力（图4E-I）。与M28Z一致，随着肿瘤细胞攻击次数的增加，干扰BATF对这五种类型的CAR-T细胞的功能影响变得更加明显。作者随后在小鼠模型种验证了BATF的功能。这一部分的实验结果进一步证实了BATF对T细胞衰竭的贡献。

图4 在6种人CAR-T细胞和鼠OT-1细胞中perturbing BATF的效果

5.BATF通过直接与衰竭相关基因结合来驱动CAR-T细胞衰竭

作者开始研究BATF限制CAR-T细胞功能和驱动衰竭的机制。经过3轮肿瘤细胞的挑战，对CAR-T细胞进行RNA-seq。与上面图2的结果一致，GSEA结果显示，与M28Z-BKO相比，M28Z中耗竭相关基因富集；与M28Z相比，M28Z-BOE显著上调了衰竭相关基因的表达（图5B）。这些结果表明BATF过表达增强了CAR-T细胞衰竭。

为了进一步分析其分子机制，作者在M28Z CAR-T细胞中进行了染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）。重复2中（527/557）大约95%的BATF结合基因与重复1（1812）重叠（图5C），表明两次ChIPseq重复序列之间的一致性和高质量的数据。BATF ChIP-seq峰的全基因组分布如图5D所示。作者对CAR-T细胞中由BATF结合的区域进行了motif分析，并发现Top的motif序列是激活蛋白1（AP-1）结合motif（TGA[G/C]TCA）（图5E），与此前的报道一致。

为了评估BATF是否直接调控T细胞衰竭，作者将人类衰竭相关基因与BATF结合的基因重叠，发现BATF与很大一部分T细胞衰竭相关基因结合（p=2.7x10-10）（图5F和G）。联合RNA-seq和ChIP-seq数据，发现这些基因中的大多数在BOE中上调，在BKO细胞中下调（图5H）。作者发现BATF直接结合上调的PDCD1（图5G和5H），以及实时定量PCR和FACS证实了在BATF超表达的CAR-T细胞中PD-1的表达显著升高。接下来，作者评估了在PD-L1过表达的CDX模型中敲除BATF的CAR-T细胞的功能。与M28Z相比，M28Z-BKO具有明显更好的肿瘤消除能力，说明M28Z-BKO在PD-L1过表达的TME中可以更有效地消除肿瘤（图5I）。这些结果表明BATF通过直接结合并上调的衰竭相关基因来驱动CAR-T细胞衰竭（图5G和H）。

为了更好地分析BATF在原代T细胞中的作用，作者使用OT-1细胞进行了RNA测序。重复肿瘤刺激，GSEA显示敲除Batf降低了OT-1细胞衰竭水平，过表达BATF增强了该水平，证实了BATF通过上调衰竭相关基因来促进T细胞衰竭。随后，作者对BATF靶基因进行GO富集分析，发现很多T细胞增殖相关基因在M28Z-BOE细胞中是上调的。这些结果与之前关于BATF正向调控T细胞增殖的观点一致。然而，在衰竭诱导条件下，BKO CAR-T细胞的细胞数量明显高于BOE，说明BATF的衰竭增强功能占主导地位。

图5 BATF导致CAR-T细胞衰竭

6.BATF编辑影响CAR-T细胞亚型

除了参与T细胞衰竭和增殖外，先前的研究也报道了BATF在效应CD8+ T细胞的分化中发挥重要作用。与这一观点相一致的是，作者发现BATF在CAR-T细胞中结合并上调了多个效应相关基因，比如RUNX3、KLRG1和TBX21（图6A和B）。为了测试BATF编辑是否影响CAR-T细胞亚型，作者使用CCR7和CD45RO作为标记物，评估M28Z、M28Z-BKO和M28Z-BOE CAR-T细胞在不同实验条件下不同亚型的分布（图6C-E）。

与M28Z CAR-T细胞相比，在M28Z-BOE 效应细胞的比例更高，尤其是在新鲜CAR-T细胞和高-E:T比例的CAR-T细胞中，M28Z-BKO的效应细胞最少，这些证实了BATF在效应T细胞形成中发挥的关键作用。BATF编辑增加了中央记忆CAR-T细胞的比例，特别是在三轮肿瘤攻击后。

作者使用PDX #1模型在体内验证了BATF对CAR-T细胞亚型的影响（图6F），与之前的体内数据一致（图3B和G），M28Z-BKO组的肿瘤生长速度慢于其他组（图6G）。M28Z-BOE在控制肿瘤生长方面没有任何效果，证实了过表达BATF负调控CAR-T细胞的功能（图6G）。然后，作者分析了第一次CAR-T细胞给药后第11天小鼠PB中肿瘤浸润性CAR-T淋巴细胞（TIL）和T细胞的亚型。他们发现在M28Z-BKO处理的小鼠的TIL和PB中有更多的中央记忆T细胞（TCM），M28Z-BOE处理的小鼠中终末分化效应T（Teff）细胞的比例增加（图6H）。在随后的时间点（第一次注射CAR-T细胞后第42天），作者还观察到，与M28Z-和M28Z-BOE处理的小鼠相比，M28Z-BKO的TILs中TCM细胞亚型的比例更高（图6I）。

这些数据表明BATF直接结合并调节效应相关和记忆相关基因的表达。敲除BATF可以降低效应T细胞的比例，在体内外向更多的TCM细胞转移，有助于更好的肿瘤消除能力。

图6 BATF编辑促进CAR-T细胞中央记忆亚型的形成

总结

该研究在体外建立了具有典型耗竭特征的人原代CAR-T细胞耗竭模型，然后作者使用功能低下的CAR-T细胞模型进行候选基因筛选，发现碱性亮氨酸拉链ATF样转录因子（BATF）的消耗改善了CAR-T细胞的抗肿瘤性能。在不同类型的CAR-T细胞和小鼠OT-1细胞中，BATF的缺失使T细胞具有更好的对衰竭的抗性和肿瘤根除效果。

在机制上，作者利用ChIP-seq发现BATF结合并上调了人类CAR-T细胞中一个与衰竭相关的基因子集。另外，BATF结合并调节参与效应T细胞和记忆T细胞发育的基因，敲除BATF将使该群体向一个更中央的记忆子集转移。证明了BATF是限制CAR-T细胞功能的关键因素，其消耗增强了CAR-T细胞对实体肿瘤的抗肿瘤活性。

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