艾美捷测序级 II,纯化胰蛋白酶实验室使用的测定方法
测序级 II,纯化胰蛋白酶背景参考:
牛胰腺表达两种形式的胰蛋白酶,主要的阳离子型和次要的阴离子型。这些蛋白质序列具有72%的同一性,而它们的编码区具有78%的同一。
这些蛋白质中的每一种都被进一步加工成不同的形式。催化胰蛋白酶包含一个灵活的“自溶回路”(残基G145-V157)(Schroeder和Shaw 1968,以及Bartunik等人1989),在该回路中的K148-S149处的显性单链形式B胰蛋白酶的自溶导致a胰蛋白酶的形成。K193-D194处的进一步自溶导致Psi胰蛋白酶的形成(Fehlhammer和Bode 1975)。
阳离子和阴离子胰蛋白酶蛋白均表达为胰蛋白酶原原酶,具有15个残基的信号肽(M1-A15)和8个残基前肽(F16-K23)。所有已知胰蛋白酶的三维折叠高度保守。此外,催化三联体和催化三联体侧翼区域高度保守(Hartley 1970)。
艾美捷测序级 II,纯化胰蛋白酶特异性:
胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸氨基酸残基的C端侧切割肽。如果脯氨酸残基位于切割位点的羧基侧,则不会发生切割。如果酸性残基位于裂解位点的任一侧,则水解速率已显示较慢。
艾美捷测序级 II,纯化胰蛋白酶化验方法:
文献中描述了各种测定。Spencer等人(1975)报道了一种使用完整蛋白作为底物的测定,该蛋白上附着有荧光染料1-苯胺-8-萘磺酸盐(ANS)。Stewart(1973)描述了一种使用显色底物N-苯甲酰基DL-精氨酸对硝基苯胺(DL-BAPA)、N-戊酰基-L-苯基对硝基苯胺的方法。Ford等人(1973)报告了使用对硝基-苯基对胍苯甲酸酯(NPGB)测定固定化胰蛋白酶的活性位点暴露,形成了稳定的酰化酶,加上在410nm处测定的对硝基苯酚分光光度法。沃辛顿实验室使用的测定方法如下所述。
在25°C、pH 8.2、0.01 M钙离子存在下,一个单元每分钟水解1μmol对甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯(TAME)。
试剂:
0.046百万特里斯⋅HCl缓冲液,pH 8.1,含0.0115 M氯化钙
0.01 M TAME(对甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯)
0.001 N盐酸
酶:
在0.001 N HCl中稀释至10-20 ug/ml的浓度。
程序:
将分光光度计设置在247 nm和25°C。
按如下方式将移液管移到每个试管中:
0.046百万特里斯⋅HCl缓冲液,pH 8.1 2.6 ml
0.01 M TAME 0.3 ml
在25°C的分光光度计中培养3-4分钟,以达到温度平衡,并建立空白率(如有)。加入0.1 ml稀释酶,记录A247 3-4分钟。从曲线的初始线性部分确定ΔA247。反应保持线性,A247约为0.320。反应应线性至少三分钟。如果不是这样,重复使用更少的酶。
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