使用 MEME 分析不同类型的 NB-ARC 结构域中 Motif 的差异

NBS-LRR 基因家族是一种常见的抗病基因家族，该基因家族在所有抗病基因中占比超过 60％。一般被子植物的基因组中包含数百个 NBS-LRR 基因家族的基因。

NBS-LRR 基因家族编码的蛋白可以分成 3 个结构域，TIR/CC/RPW8 + NBS + LRR，根据蛋白 N 端的结构域可以将 NBS-LRR 分为三类：T (TIR) NL、C (CC) NL 和 R (RPW8) NL。

本文通过使用 MEME 工具包来分析 TNL、CNL、RNL 三类蛋白中 NBS 结构域的差异。数据集为从 www.rosaceae.org 数据库网站上下载的 19 种蔷薇科植物的蛋白质 fasta 文件。方法主要参考文献《Genome- Wide Analysis of the Nucleotide Binding Site Leucine-Rich Repeat Genes of Four Orchids Revealed Extremely Low Numbers of Disease Resistance Genes》，Front. Genet.，08 January 2020。

PS：有关 MEME 工具包的介绍详见 MEME 使用简介。

一、使用 MEME 分析蛋白质序列

使用 Hmmer 筛选出 19 种蔷薇科植物中包含 NB-ARC 结构域的蛋白。具体过程参见使用 Blastp 和 Hmmer 筛选出包含特定结构域的蛋白。
将筛选出的蛋白序列提交至 NCBI 的 CD-Search 分析，确定筛选出的蛋白所包含的全部结构域。
根据 CD-Search 的结果筛选出同时包含 TIR + NB-ARC、RX-CC + NB-ARC、RPW8 + NB-ARC 结构域的蛋白，并分类提取出三类蛋白的 NB-ARC 结构域的氨基酸序列信息。
对提取出的 NB-ARC 结构域进行过滤，以 [75% mean-length，125% mean-length] 作为过滤标准，其中为 mean-length 为各类 NB-ARC 结构域的平均长度。
将长度较为统一的 NB-ARC 序列作为输入用 MEME 进行分析。在线观看 Motif Logo 的同时下载结果（MEME HTML output >> Submit/Download >> Download Motif >> FASTA 或 Raw）。
注意！ 面对大批量序列的 Motif 分析本应当使用 STREME，而非 MEME。但 STREME 的输出结果不包含 Motif 在每个蛋白中的具体序列信息，故这里使用 MEME。
将 MEME 挖掘到的 Motif 与参考文献中的 Motif 比较，挖到了 P-loop、Kinase-2、Kinase-3、RNBS-C 和 GLPL 五个 Motif，没有挖到 RNBS-D Motif。
注意！ 在没有参考文献进行比较的情况下，可以通过 Tomtom 将 Motif 与已知 Motif 进行比对，预测 Motif 的功能。
观察 MEME 的 Motif Logo 发现，各类 NB-ARC 中挖掘到的包含相同核心氨基酸的 Motif 长短不一，并且核心氨基酸在 Motif 中的位置也不固定。下面三幅 Motif Logo 分别是 RX-CC、TIR、RPW8 的 P-loop Logo。Motif 的长度分别为 21、21、29，GKTT 氨基酸分别处在 Motif 的 10、9、13 位点。Motif 长度不一及核心氨基酸位置的偏移给 Motif 间的比较带来了困难。所以这里我以核心氨基酸为中心，上下游截取相同数量的氨基酸，提取出 Motif 在各类蛋白中的序列信息。如 P-loop 以 GKTT 为核心氨基酸，上游取 8 个氨基酸，下游取 2 个氨基酸。

二、使用 WebLogo 绘制 Motif Logo

WebLogo 提供绘制 Motif Logo 的功能，输入文件为 固定长度的 Motif 序列。将上述步骤提取出来的 Motif 作为 WebLogo 的输入，结果如下，分别为 RX-CC、TIR、RPW8。