PNAS：节食可调节年轻人脑网络的稳定性

流行病学研究表明，胰岛素抵抗加速了与年龄相关的认知障碍的发展，这与大脑对葡萄糖的代谢降低有关。作为细胞输入，与葡萄糖相比，酮使ATP的Gibbs自由能变化增加了27%。本文检验了节食变化是否能够通过将主要食物来源从葡萄糖变为酮来调节大脑各区域间的功能交流（网络稳定性）。首先使用两个（n=292，年龄20-85岁；n=636，年龄18-88岁）3T功能MRI（fMRI）数据集，建立网络稳定性，以作为大脑衰老的生物标记物。为了确定节食是否会影响大脑网络的稳定性，又使用了单受试者的超高场（7T）、超快速（802 ms）fMRI，额外扫描了42名年龄小于50的成年被试的大脑。另一组在标准饮食、隔夜禁食和生酮饮食条件下分别进行了扫描。为了分离食物类型的影响，在给予热量相匹配的葡萄糖和外源性酮酯（D-β-羟基丁酸）丸剂之前和之后，对一个独立的隔夜禁食队列进行扫描。

研究结果发现，在整个生命周期中，脑网络的不稳定与大脑活动和认知敏锐度的下降相关。这种效应从47岁时开始出现，到60岁时退化的最快。无论是否通过生酮饮食或外源酮酯实现酮化，葡萄糖均会使网络不稳定，而酮会使网络稳定。总之，本文的结果表明，脑网络的不稳定可能反映了与痴呆相关的代谢降低的早期迹象。饮食干预使得酮的利用率提高，进而增加了可用能量，因此节食可能具有保护老化大脑的潜力。本文发表在PNAS杂志。

介绍

由于人脑的体积仅占人体体积的2%，但却消耗了超过20%的能量，因此它特别容易受到新陈代谢变化的影响。在过去的100年中，节食中血糖负荷的增加导致了胰岛素抵抗（2型糖尿病[T2D]）的全国性流行，几项大规模流行病学研究已将其确定为晚年痴呆的早期风险因素。例如，一项对英国Whitehall II队列研究（n=5653）的事后分析报告称，糖尿病患者的记忆力下降速度加快45%，推理能力下降速度加快29%，全脑认知能力下降速度加快24%，T2D中年患者认知能力加速下降的风险与病程和血糖控制有关。来自以色列（n=897）和美国（n=4135）的队列也报告了类似的结果，后者发现T2D和认知功能障碍之间的关系在年轻人中也很明显。这种显著的关联使研究人员设想：痴呆可能是大脑代谢疾病的表现。

这种关联之所以如此惊人，是因为直到最近，人们还认为大脑完全利用不依赖胰岛素的葡萄糖转运蛋白3进入细胞（GLUT3），即既不利用胰岛素也不利用胰岛素转运（GLUT4）。然而，现在有越来越多的证据表明胰岛素与神经元、大脑老化和相关的记忆缺陷直接相关。例如，一项使用放射性胰岛素染色的研究发现，大鼠大脑的海马体和皮质中都密集地分布着胰岛素受体，这与神经元不利用胰岛素的假设恰好相反。人类的正电子发射断层扫描显示，与健康对照组相比，胰岛素抵抗被试的葡萄糖摄取减少，这表明即使是T2D的最早阶段也会诱发神经元代谢降低，就像身体其他细胞和大脑中常见的葡萄糖低代谢一样。最后，在不增加葡萄糖的情况下，注射胰岛素可以提高阿尔茨海默症患者的记忆力。这些临床研究表明，胰岛素抵抗的有害认知影响可能是由代谢压力引起的，因为神经元逐渐失去获取葡萄糖的途径。如果是这样的话，就有可能通过利用酮体作为替代物来绕过胰岛素抵抗重新供给神经元。

内源性酮体，包括D-β-羟基丁酸，主要是在肝脏中由脂肪组织在低热量/禁食状态或遵循低碳水化合物/中等蛋白质/高脂肪节食时释放的长链和中链游离脂肪酸产生的。在大鼠实验中，糖皮质激素诱导的海马胰岛素抵抗的神经和认知影响被酮体（D-β-羟基丁酸）和甘露糖逆转录，但葡萄糖或果糖都不能逆转录。同样，在人类中，有证据表明，即使老年人的大脑葡萄糖代谢降低（甚至是阿尔茨海默症特有的最严重的葡萄糖代谢降低），酮体的神经摄取也仍然不受影响。最终，终身低热量诱导的酮可保持老年动物的突触可塑性和认知能力[实际年龄相当于人类的约87到93岁]。

不过，除了缩短胰岛素抵抗的能力外，酮还有其他的代谢优势，这些优势甚至可以给尚未处于缺陷（低代谢）状态的年轻健康个体带来神经生物学上的好处。在这些优势中，最基本的一个是，作为细胞输入，与葡萄糖相比，β-羟基丁酸分子使ATP的Gibbs自由能增加了27%。虽然目前尚不清楚增加可用能量是如何影响大脑健康的，但先前的动物数据表明——神经递质产量增加了。8-10个月大的小鼠，相当于27-33岁的人类，在间歇性禁食诱导的酮症期间显示突触效率增加、低theta波段振荡和学习巩固。从机制上讲，这种突触效率的提高与谷氨酸的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的表达增加有关。

本文基于以上背景验证了两个假设。首先，调查人类大脑衰老的时间过程，以确定是否有证据表明长期退化进程为神经代谢压力奠定了基础——在认知效应变得明显之前的几十年。这在临床上至关重要，因为它确定了一个时间窗口：在此期间，如果我们能增加神经元对能量的获取，那么神经退行性的影响可能就是可逆的了。其次，为了分离能量在调节这个变量中的作用，我们保持年龄不变，同时测试将人类大脑的主要食物来源从葡菊糖转换为酮体对神经生物学的影响。上述转化结果表明，禁食提高了NMDA驱动的突触效率；反过来，神经传递也驱动了脑血流量的变化，从而通过静息态血氧水平依赖（BOLD）功能磁共振成像（fMRI）测量大脑区域之间的功能连接。因此，本文假设酮体可能会改善由fMRI衍生的与功能相关的神经生物学测量。而且，即使在健康的年轻人中也是如此。

本文分两个阶段验证这些假设。首先，使用独立的大规模人类fMRI数据集，在整个成年人的生命周期内（18-88岁）进行采样，建立一个与大脑老化密切相关的全脑尺度的生物标记物（网络稳定性，定义为大脑保持区域间功能连接的能力）。其次，在人类身上进行了两个有针对性的实验，优化了单受试者水平的检测灵敏度，同时使用节食和丸剂，以测试食物类型：葡萄糖和酮体对生物标记物的影响。值得注意的是，虽然转化研究倾向于采用长期（“终身”）的节食调整--相当于人类寿命的20-30年--但在我们的目标实验中，我们有意关注的是快速效果（节食1周和摄入D-βHb酮酯半小时后)。这样做有三个原因：首先，它允许在受试者内进行实验设计，从而严格控制受试者间的遗传和环境差异。其次，它将潜在生物机制的数量缩小到能够在几分钟或几天内发挥作用的生物机制，而不是几个月、几年或几十年。最后，通过使用大多数人在现实世界环境中都能实施的节食调整来最大化临床相关性。

方法

神经成像数据集。识别整个生命周期的网络稳定性，分析了两个大型开源3T静息态fMRI的数据集：（1）Leipzig：年龄在20-85岁之间，n=292和（2）剑桥中心老龄化和神经科学阶段II（Cam-CAN，年龄在18-88岁之间，n=636）。Leipzig 50岁以上和50岁以下被试的年龄呈双峰分布，需将年龄作为离散变量进行统计分析。Cam-CAN在整个生命周期内均匀采样，可将年龄作为连续变量进行统计分析。

代谢神经成像数据集。为了确定食物是否会影响大脑网络的稳定性，对两组独立的年轻健康成年被试进行了静息态扫描。研究人员要求受试者睁开双眼，思想放空，同时专注黑色屏幕上的白色定向十字。为了获得单受试者水平分析所需的更高信噪比的数据，在Massachusetts General Hospital Athinoula A. Martinos生物医学成像中心使用超高场（7T）fMRI对参与者进行扫描，使用动态模型定量优化的采集参数来检测静息态网络的灵敏度。在每次扫描之前和之后，使用Precision Xtra测试条（Abbott Laboratories）测量血糖和酮（D-β-羟基丁酸）（Table1）。所有三项研究的排除标准包括超高场成像的MR禁忌症；精神和/或神经系统疾病的诊断；创伤性脑损伤；娱乐性药物使用，包括严重饮酒；和/或（对于女性）怀孕。如果参与者目前或最近（在过去6个月内）遵循低碳水化合物或生酮饮食，则被排除在外。所有参与代谢研究的被试的详细临床和人口统计学特征可在SI TableS1中找到。研究在ClinicalTrialsgov上注册为临床试验（编号CT4106882）并获得Massachusetts General Hospital（Partner’s Healthcare）and Stony Brook University委员会批准：所有参与者均提供知情同意。如需访问相关数据集和用于处理和分析数据的代码，请参阅数据集S1-S4。

对于第一个实验（diet）(n=12，=28±7；4名女性)，我们在三种情况下扫描参与者：

1）标准饮食：按照他们的标准饮食，不禁食；

2）禁食：按照他们的标准饮食，禁食一晚（12h）；

3）生酮饮食：在生酮饮食（高脂肪、中等蛋白、低碳水化合物[<50g/d]）1周后，所有被试均处于酮症状态（>0.6mmol/L酮血浓度）。

对于第二个实验（bolus）(n=30，=28±8；18名女性)，我们在三种情况下扫描了一组独立的参与者：

1）禁食：遵循标准饮食，禁食过夜；

2）葡萄糖丸剂：用葡萄糖饮料代替禁食（葡萄糖耐量测试饮料，FisherScientific Inc）；

3）D-βHb酮酯丸剂：用酮饮料（D-β-羟基丁酸酮酯：HVMN）代替禁食。

每位被试的D-βHb酮酯剂量为395mg/kg，并且在D-βH酮酯（μKETdose=26.65±3.97g）和葡萄糖（μGLUdose=31.33±4.57g）之间进行热量匹配（μcal=125±19）。在神经成像之前，我们使用糖化血红蛋白（HbA1c (μHbA1c=5.14±0.32% [min/max=4.6至5.8%；胰岛素抵抗>5.6%])）和胰岛素抵抗稳态模型评估（HOMA-IR）（μHOMA-IR=1.41±0.59 [min/max=0.41至2.87；胰岛素抵抗>2.0]）来计算胰岛素抵抗。HOMA-IR计算公式为空腹胰岛素(μU/mL)×空腹血糖(mg/dL)/405。

虽然酮在人外周血浓度方面的药代动力学已经明确，但在人脑方面的药代动力学尚不清楚。因此，为了确定丸剂研究的最佳时间，我们首先进行了磁共振波谱（MRS）研究（n=8；μage=27±5；3名女性），以确定丸剂在大脑中的时间。使用被试内部时间lock设计，以及如下所述的体重和热量相匹配剂量，我们在基线时测量了大脑葡萄糖和β-羟基丁酸，然后在给药后每5分钟测量一次，持续90分钟。根据SI附录，图S2，MRS显示，在给药约30分钟后，葡萄糖和酮在大脑中的浓度达到峰值。在这两种食物类型中，葡萄糖比酮作用更短，更容易挥发（葡萄糖的峰后变异系数为2.1±0.8，D-βHb酮的峰后变异系数为0.14±0.03；P=0.04），酮在给药至少90分钟后仍保持峰值。因此，为了确保大脑中葡萄糖和酮的浓度达到峰值，在大剂量给药实验中，我们从给药30分钟后开始进行10分钟的静息态扫描。

为了检查节食和丸剂之间的潜在相互作用，及测试D-βHb酮是否可以抵消较高的血糖负荷的影响，我们又额外对一名被试（案例研究：女性，47岁，糖化血红蛋白=5.8%）进行了研究。在案例研究中，基线条件包括在扫描前30分钟在标准饮食中补充75g葡萄糖，这是临床用于口服葡萄糖耐量试验的标准剂量。在一个lock时间中，被试被扫描两次：一天使用（395mg/kg）25g剂量的D-βHb酮，另一天不使用。这两种情况都是在静息态和执行空间导航和运动任务时进行的，具体如下所述。

MRI获取

两组数据均是在3T场强下获得的。Leipzig：TR=1400ms，采集时长为15min30s；Cam-CAN：TR=1970ms，采集时长为8min40s。考虑到临床应用，要求单受试者水平分辨率，所有代谢数据均在超高场强（7T）下获取，包括全脑BOLD（回波平面成像，EPI）、场图和T1加权结构（多回波磁化准备的快速梯度回波[MEMPRAGE]）成像。使用定量优化协议和动态模型（BrainDancer；ALA Scientific Instruments）获取BOLD图像，以检测静息态网络的灵敏性：同时多层（SMS）加速因子等于5，初级相位编码方向的加速度R=2（62 reference lines）和在线广义自校准并行采集（GRAPPA）图像重建，TR=802ms，回波时间（TE）=20ms，翻转角=33°，体素大小=2×2×1.5mm，slices=85，并且在每次使用丸剂前后间隔中的测量次数为2320，总采集时间为62min。采用以下参数获取Field map图像：TR=723ms，TE1=4.60ms，TE2=5.62ms，翻转角度=36°，体素大小=1.7×1.7×1.5mm，slices=89，总采集时间为3min14s。全脑T1加权结构数据是用1mm各向同性体素大小和具有以下协议参数的四个echoes获得的：TE1=1.61ms，TE2=3.47ms，TE3=5.33ms，TE4=7.19ms，TR=2530ms，翻转角=7°，主相位编码方向加速度R=2（32 reference lines）和在线GRAPPA图像重建，总采集时间6min3s。

空间导航与运动任务

在节食和案例研究中，为了评估这种影响是否不只存在于静息态，从而增加认知负荷并因此增加大脑代谢的需求，被试还使用兼容MR的操纵杆（Nata Technoloqies）在虚拟现实中走迷宫。我们使用Daedalus中的Aldous-Broden算法创建了这些迷宫，并使用Vizard（WorldViz）编程虑拟现实扫描环境。在空间导航任务中，利用空间编码和记忆来寻找从迷宫一端到另一端的路线。在运动任务中，被试只需沿着通道走。

磁共振成像预处理

使用FMRIB处理：解剖图像的颅骨剥离，并与MN1模板和平均功能图像共配准。功能图像经过头动和field map校正，大脑提取，并使用通过解剖图像学得的转换与MNI模板共配准。使用SPM12对代谢数据预处理。采用统一的分割和配准方法，将解剖图像（MEMPRAGE）归一化为MNI模板。对每个被试的图像进行重排列以校正头动和场强畸变引起的磁场不均匀性，然后归一化到MNI空间。使用基于成分的校正方法（CompCor）去除生理带来的混淆噪声。没有进行空间平滑。对于所有数据集，基于体素的数据被分割到Willard 499功能感兴趣区（ROI）Atlas中，之后，该Atlas将粗粒度数据划分到14个静息态网络中。

fMRI网络分析

为了探索跨大脑区域的时间动态和通信重组（脑区间的连通，称为脑网络，以及这些网络随时间的持续性，被定义为网络稳定性），将ROI水平的fMRI时间序列分为24s的非重叠时间窗口或“快照”。从每个窗口中提取了一个多对多的、有标记的、对称的相关强度网络。我们以两种互补的方式量化大脑网络的稳定性。为了测量总体差异，我们计算了总体不稳定性，并将其定义为大脑网络每一对不同窗的相关矩阵中的差分（标量）范数，其中τ是持续时间（以24s为计量单位），在此基础上量化持续性（SI附录，图S5）。为了识别出大脑中哪些网络对这些影响起主要作用，我们根据自动解剖标记图谱（AAL；http://wwwgin.cnrsfr/en/tools/aal-aal2/）定义的静息态网络和结构分割，使用LASSO回归预测年龄，将网络的不稳定性作为特征。该预测确定了一个具有最少系数的、数据驱动的概念，即大脑年龄。为了测量大规模的功能重组，我们从节食研究中搜集了fMRI数据（n=12），计算了模块不稳定性，其表明网络模块中的节点随时间切换模块的程度。模块被定义为网络中所有节点的非重叠分区，使得模块内连接相对于模块间连接最大化。对于每个网络矩阵，使用Louvain无参数模块最大化算法提取模块。

为了获得（标量）模块不稳定性，我们对所有节点取平均值：计算同一模块中未能在下一个网络快照中保持在同一模块中的节点邻居的百分比。最后，为了量化大脑的总体活性，我们计算了全脑信号的低频（0.01~0.1Hz）振幅（ALFF）。

结果

脑网络随着年龄的增长变的不稳定。在Cam-CAN测量的整个生命周期中，认知敏锐度随着年龄的增长而下降，这是通过用于评估痴呆的标准临床仪器--简易精神状态检查（MMSE）测量的（r=-0.30，P=3.63x10-15）。Cam-CAN和Leipzig静息态数据表明，年龄的增加与大脑网络的不稳定相关（Leipzig<50岁[n=214]vs.≥50岁[n=78], Mann–Whitney U test=0.28, P=1.4×10−8; Cam-CAN<50岁[n=281]vs.≥50岁[n=355], Mann–Whitney U test=0.27, P=1.6×10−22; Fig.1A, Left）。这一效应主要是由三个静息态功能网络驱动的：听觉（颞上回）、高级视觉处理（V2）和基底神经节（丘脑、尾状核、额下回）。以12个静息态网络的不稳定性为预测变量，年龄为被预测变量的LASSO回归发现：这3个网络具有较高选择性（r=0.30, P=7.11×10−19），而其他网络权重均为零。与年龄相关的网络稳定性退化呈S型（Fig.1A，Right；n=636；S型降低χ2=1.07，线性降低χ2=1.39），拐点为60±2岁，拐点时网络稳定性下降最快。S型线最早始于13岁；因此，在整个寿命周期中，我们的大脑网络约在47岁时开始变不稳定。重要的是，这表明大脑衰老的第一个潜在标记可能能够在认知症状变得明显的前十几年进行神经生物学检测。

由Cam-CAN数据驱动的，对脑龄影响最大的三个网络：听觉（βnorm/raw：0.25/1.77）、高级视觉处理（βnorm/raw：0.35/2.51）和基底神经节（βnorm/raw：0.16/1.19）网络，被线性组合成一个变量用于表示脑龄（其实就是模型的预测结果）。脑龄与认知敏锐度呈负相关（Fig.1B，Left）。此外，与年龄相匹配的健康对照组相比，对于更年轻的被试，T2D加快了大脑的衰老速度（Fig.1B, Right）。有（51±4岁）T2D和无（51±5岁）T2D的年轻被试的平均实际年龄相当，而年轻糖尿病患者的脑龄却显著高于健康对照组(年轻T2Dvs.HC, Mann-Whitney U test=0.34,P=0.0002）。对于老年人，有T2D（73±6岁）和无T2D被试（74±6岁）的平均实际年龄和脑龄无显著差异（老年T2Dvs.HC, Mann-Whitney U test=0.48,P=0.87）。因此，患有T2D的年轻个体表现出大脑网络不稳定（即脑龄），而对于非糖尿病患者来说，这种情况通常出现在老年被试中。

Fig.1 大脑网络随着年龄的增长变的不稳定，对听觉、高级视觉（V2）和基底神经节网络（n=928）的影响最大

(A)莱比锡脑-脑-体开放源数据集，年龄20至85岁，二值化为较年轻(n = 214)与较年长(n = 78)的受试者(Mann-Whitney U = 0.28；P = 1.4×10-8)和Cam-CAN开放源数据集，年龄18至88岁，二值化为较年轻(n = 281)与较年长(n = 355)的参与者(Mann-Whitney U检验= 0.27，P = 1.6×10-22)。使用Sigmoid函数（即逻辑回归）(权重与SD成反比的非线性最小二乘，简化χ2 = 1.07)拟合Cam-CAN数据集的网络不稳定性。从该拟合中，获得了拐点(转换点)，出现在60±2y，拐点的起始在47时就出现。

(B)以网络稳定性为定义的脑龄越大，预测的认知能力越低(即和MMSE评分负相关)。大脑年龄与MMSE评分数据的线性拟合发现斜率为–0.66±0.27(估计SE)，这意味着MMSE评分每下降一点，不稳定性导致的脑龄增加0.66y(P < 0.01，CI =[–1.18，–0.14])。对于较年轻的个体，与年龄匹配的健康对照组相比，T2D加速了大脑老化。年轻糖尿病患者的脑龄显著高于健康对照组(年轻T2D与HC，Mann-Whitney U = 0.34，P = 0.0002)。对于老年患者，t2d(73±6y，n = 14)和HC(74±6y，n = 82)的平均实际年龄与其各自的脑龄相当。

酮症稳定大脑网络

实验调节的食物摄入表明，年轻健康被试的脑网络通过酮症变得稳定，包括1周的节食（τ=1，事后重测ANOVA最小显著性差异（LSD），标准和生酮饮食：t=5.4，P=0.0000001，n=12；Fig.2A）和摄入外源性D-βHb酮酯（τ=1，配对t检验，葡萄糖快速禁食vs. D-βHb酮酯快速禁食，t=2.9，P=0.004，n=30；Fig.2B）30分钟后引起的酮症。总体而言，节食诱导的酮症和饮用外源性D-βHb酮酯诱导的酮症显示出与禁食相同的效果，而标准饮食和葡萄糖丸剂持续破坏大脑网络。作为一项衡量标准，网络稳定性显示出强大的重测可靠性，在丸剂研究的两次禁食期间，平均间隔4天（±2天）时，被试的内部差异最小，（τ=1，重测ANOVA LSD事后，禁食1与禁食2，P=0.28，n=30；SI附录，Fig.S3）。

即使在单参数水平上，我们的案例研究也清楚地显示，即使在高血糖负荷下，D-βHb酮酯也具有稳定大脑网络的作用（τ=1，配对t检验，标准饮食+75克葡萄糖丸剂加D-βHb酮酯丸剂与不加D-βHb酮酯丸剂，t=4.12，P=0.000；;Fig.2C和SI附录，Fig.S4）。SI附录、Fig.S2和表Table S2提供了案例研究的血液值。

进一步的分析表明，网络不稳定是由网络模块的大规模重组引起的（网络切换；附录SI，Fig.S5A和S6A和B），而不是在保留模块的同时改变连接强度（网络变暗或者闪变；附录SI，Fig.S5B和S6C和D）。与标准饮食相比，生酮饮食或禁食的被试在静息和任务条件下，fMRI信号的ALFF值始终较高（静息态：P=1.1×10−3；运动任务态：P=1.3×10−6；空间导航任务态：[前期：0至10min]：P=6.7×10−5；空间导航任务态：[后期：10至40min]：P=7.7×10−17，n=12；Fig.3）。跨数据集，随着ALFF的减少，网络切换变得越来越显著（节食：r=–0.39，P=0.00003；Leipzig：r=–0.33，P=2.63×10−7；Cam-CAN：r=–0.25，P=4.15×10−13）。

根据所有节点的总ALFF得到的活性来表征每个网络，然后我们比较了每个“转换”的对称性：从低活性网络到高活性网络的转换与从高活性网络到低活性网络的转换。酮和禁食条件均显示平均零偏差（单样本t检验，生酮饮食：t=–0.22，P=0.83；禁食：t=0.26，P=0.80），而标准饮食条件使大脑倾向于从高活性状态切换到低活性状态（标准饮食：t=–3.29，P=0.007）。因此，网络转换可能反映了大脑无法维持更活跃、代谢负担更高的网络的成本，从而默认使用代谢“更便宜”的替代方案。

Fig.2大脑网络因葡萄糖而不稳定，因酮而稳定

(A)在饮食实验中，对每个受试者分别进行了三次扫描，时间锁定在一整晚，以消除昼夜变异性:在标准饮食(STD)后、隔夜空腹后和生酮饮食1周后进行测量(τ = 1，重复测量ANOVA LSD事后分析，标准与生酮饮食:t = 5.4 P = 0.0000001)。 (B)为了将能量来源作为饮食之间的感兴趣变量进行隔离，本研究进行了追加实验。对每名受试者分别扫描两次，再次进行时间锁定，以消除昼夜变异性，然后将D-βHb酮酯和葡萄糖单独按重量给药(395 mg/kg)。对于每个疗程，从每个推注值中减去了节段内空腹值(τ = 1，配对t检验，葡萄糖推注减去空腹与酮酯推注减去空腹:t = 2.9，P = 0.004)。 (C)即使在高血糖负荷下也观察到酮酯的稳定作用；这里显示了单名受试者在标准饮食(包括75 g葡萄糖激发)加和不加酮酯给药后的网络稳定性值(τ = 1，配对t检验，高血糖标准饮食加和不加25 g D-βHb酮酯推注:t = 4.12，P = 0.0001)。

补充图S1 磁共振波谱成像选取的感兴趣区

补充图S2 在给药后，葡萄糖和酮的含量的变化

平均β-羟基丁酸盐(βHb/Cr+PCr)和葡萄糖在酮和葡萄糖推注后约30分钟达到峰值附近，脑(体素以前扣带回为中心)中的Glc/Cr+PCr水平达到峰值，并在推注后至少90分钟继续保持峰值。根据本文的研究设计，大脑中葡萄糖的挥发性增加(与酮相比)清晰可见，表明应在推注后30-40分钟进行比较两种给药的静息态扫描。

Fig.S3 脑网络稳定性收到葡萄糖和酮的明显影响，酮的摄入显著增加了脑网络的稳定性（即instability 下降）

采用受试者内设计(追加实验，N=30)，基线两天的(空腹)条件产生了差不多的网络稳定性值。在葡萄糖与D-βHb酮酯给药后，与基线时的网络稳定性存在明显差异，具有统计学意义(p≤0.01)。血糖状况与两种(基线)空腹状况有显著差异(p≤0.001)。

Fig.S4 不同给药后任务态中网络稳定性和随时间变化的脑网络稳定性，可以看出生酮饮食条件下的脑网络稳定性上升。

A)运动和B)空间导航任务的单个参与者结果显示，在认知负荷下稳定网络方面，酮酯表现出与该个体的静息状态结果相当的效果。该被试在两种情况下接受检测，一种是标准饮食伴高血糖负荷(75g葡萄糖挑战)，同时给予或不给予25g D-βHb酮酯丸剂，每种10分钟条件连续扫描三次。当卡路里匹配时，使用D-βHb酮酯丸剂观察到等效的效果，表明网络稳定不是由于不同条件下的卡路里差异导致的。

Fig.3 与标准(std)饮食相比，生酮饮食的参与者(n = 12)的ALFF增加。

从图中可以，这个结果对于静息状态，以及运动和空间导航任务都是如此。静息状态和运动任务持续10分钟。空间导航显示第一个10分钟(用于与其他任务比较)，然后是另外的30分钟，总共40分钟。这样做是为了评估长期疲劳的影响。这里的分析比较的是从较低活动状态到较高活动状态的转变与从较高活动状态到较低活动状态的转变之间的alff的差异，生酮和禁食条件均显示出变化为零的平均值(单样本t检验生酮饮食:t =–0.22，P = 0.83隔夜禁食:t = 0.26，P = 0.80)，而标准饮食条件显示大脑从高活动状态转换到低活动状态(标准饮食:t =–3.29，P = 0.007)

讨论

本文的数据提供的证据表明，从47岁左右开始，大脑网络的稳定性开始随着年龄的增长而下降，最剧烈的变化发生在60岁左右。由于葡萄糖代谢率低是痴呆及其前期的临床标志性特征之一，本文假设随着年龄增长而出现的网络不稳定可能反映了潜在代谢应激的早期阶段。因此，本文测试了具有不同能量的饮食是否可以调节网络稳定性，即使在预计比任何基于年龄的认知障碍的明显症状早几十年的年轻人中也是如此。虽然葡萄糖通常被认为是大脑的默认原料，但与葡萄糖相比，β-羟基丁酸代谢使ATP的Gibbs自由能变化增加了27%。与这一优势一致，本文的研究表明，即使在年轻的成年人（<50岁）中，节食引起的酮症也会增加整体大脑活性并稳定功能网络。本文首先控制饮食，以评估食物选择对大脑的真实影响。然而，在现实环境中，饮食是一个复杂的变量，因此不能区分观察到的变化是由被消耗的（例如碳水化合物）还是被合成的东西（例如脂肪）引起的，甚至不能区分这些变化是否反映了不同的热量摄入（例如，由于饱腹感的不同）。因此，本文跟进了第二项研究，其中所有参与者都遵循他们的节食标准，禁食过夜，并在禁食状态下进行扫描，然后在饮用剂量和卡路里匹配的丸剂后30分钟时再次扫描：其中一天摄入葡萄糖，在另一天摄入D-βHb酮。结果发现，节食酮症的稳定效应与通过外源性酮给药相同，这表明，调节饮食观察到的影响是特定于葡萄糖与酮的代谢，而不是在饮食之间看到的更全面的变化。

应该注意的是，分离每种食物类型影响的一个困难是外源性酮在降低血糖水平方面经常可以观察到的副作用（但其本身具有临床益处）。这反映了先前报道的两种食物之间的存在一种偏差：无论何时，无论大脑需不需要，酮只要出现都会立即被大脑吸收，而葡萄糖只有在大脑需要时才会通过GLUT转运体被细胞吸收。因此，在外源性酮与葡萄糖同时给药的状态下，酮使细胞饱和，葡萄糖的脑代谢率被下调。然而，只有当葡萄糖水平异常升高时，酮才会通过降低葡萄糖水平来稳定网络，这可能是由于胰岛素抵抗或生理扰动丸剂的作用。即使在非胰岛素抵抗个体中也观察到网络稳定效应——是在节食糖酵解的稳定状态下进行测试的——这一事实表明，这些效应是酮症的结果，而不是高血糖的病理状态。

接下来，本文考虑了酮症的一些系统性生理效应，如利尿（从而降低血压）或减少细胞对氧气的需求，可能会影响我们基于fMRI的结果。然而，如果是这样，在酮条件下BOLD信号会下降。在这种情况下，ALFF和网络稳定性增加的事实表明，所观察到的神经生物学效应不是由水或氧的整体变化引起的。另一方面，由于酮可以增加心脏和大脑的血流量，脑血流量的增加将与BOLD增加一致，因此也与ALFF一致，但与网络行为不符。我们观察到，结合动脉自旋标记和fMRI的实验表明，脑血流量增加与fMRI连接增加有关，这是一种连接强度的调节。然而，观察到的网络不稳定性反映了不同质的行为，其中网络在不同的拓扑结构之间转换。正如之前的动物实验所示，我们认为这种行为与突触传递机制更一致。在细胞水平上的能量可用性，影响神经信号“重定向”的潜在机制，将是未来多模态和转化研究的一个重要方向。

在节食和丸剂实验中，D-βHb酮酯和禁食在稳定脑网络方面发挥了相同的作用。糖原在肝脏和骨骼肌中储存时，通常可维持糖酵解长达30小时。然而，大脑主要利用储存在神经胶质中的糖原，13C MRS显示，人类的糖原会在5到10小时内耗尽。因此，经过标准的通宵禁食约10至12小时后，非胰岛素抵抗参与者的大脑很可能已经处于内源性酮病状态，即使还不能通过血液或尿液测量外周酮病检测到这一点。总之，我们的神经成像结果支持这样一种假设，即至少有一些低热量状态的有益神经效应，如间歇性禁食、严格的热量限制和锻炼，这可能是大脑将酮体转化为食物的结果。虽然对于健康的个体来说，内源性酮症的好处可以通过多种方式自然实现（例如生酮饮食、禁食、锻炼），但对于胰岛素抵抗的人来说却不一定，因为长期升高的胰岛素水平与胰岛素抵抗相关——即使在禁食期间也存在——在生理上抑制了胰高血糖素并因此抑制了酮生成。因此，虽然我们发现内源性酮和外源性酮在稳定年轻健康成年被试的脑网络方面在本质上是相似的，但对于胰岛素抵抗个体而言，外源性酮可能提供有用的辅助，以实现内源性酮症所见的神经生物学益处，这是未来研究的新领域。

最后，本文将重点放在调整食物来源的急性效应上，这与在比较饮食的大规模流行病学研究中发现的差异相关的几个潜在机制有关。例如，胰岛素抵抗被认为会间接促进血管性痴呆，因为高血糖会增加炎症并阻断一氧化氮，从而有效地缩小脑血管，同时增加血液粘度。关于阿尔茨海默症，最近的研究结果表明，有一种胰岛素降解酶在从大脑中清除多余的胰岛素和淀粉样β蛋白方面发挥着关键作用。由于胰岛素和蛋白质相互竞争同一种酶，与胰岛素抵抗相关的持续高胰岛素水平的后果之一是酶的消耗，并因此造成了β-淀粉样蛋白沉积。此外，酮已被证明可以减少炎症和活性氧的产生，并上调大脑中的线粒体。虽然所有这些可能在认知障碍发生前的几个月或几年里产生显著的累积和协同效应，但大脑对饮食改变一周或单剂量D-βHb30分钟后的反应速度之快令人吃惊。这种快速反应有效地阻断了间接的炎症、抗氧化剂、tau/淀粉样蛋白，和/或自适应线粒体的激活机制，使我们能分离出节食对新陈代谢更直接的作用。虽然还需要进一步的实验从微观尺度上阐明该机制，并探索其在较长时间内对老化大脑的影响，但网络稳定性的近乎即时的变化，即使在单被试规模上也清晰可见。他们认为，饮食干预可以在与临床干预相关的时间尺度上产生显著和可测的神经生物学效应。

总结

为了更好地理解节食是如何影响大脑衰老的，本研究将重点放在出现症状前的阶段，在这一阶段预防可能是最有效的。本文首先使用大规模神经成像数据集发现，大脑各区域之间的功能交流随着年龄的增长，通常从40多岁开始变的不稳定，这种不稳定与认知能力下降有关，并与胰岛素抵抗有关。然后通过有针对性的实验表明，这种大脑衰老的生物标记物可以通过消耗不同的食物来调节大脑网络的稳定性：降低葡萄糖，增加酮。这种效应在节食和特定热量相匹配的丸剂中都可得到，这种效应会导致大脑整体活性发生变化，这表明网络“转换”可能反映了大脑在资源限制下对能量守恒的适应性反应。

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