癌症由于其极高的患病率和致死率成为一直困扰着我们的问题，目前也有许多治疗癌症的方法，其中饥饿疗法由于较低的副作用，吸引了很多人的目光。虽然营养饥饿疗法可以在多种癌症中产生强烈的抗肿瘤作用，已有研究表明癌细胞可以利用肿瘤微环境 (TME) 在营养不良的环境中茁壮成长。

在今年 12 月 6 日，Cell Metabolism 上发表了一篇名为 ”Cancer cells co-opt nociceptive nerves to thrive in nutrient-poor environments and upon nutrient-starvation therapies” 的文章。文章表明在口腔粘膜癌的低糖环境中，癌细胞利用活性氧触发的 c-Jun 的激活来分泌神经生长因子 (NGF)，NGF 调节痛觉神经以产生降钙素基因相关肽 (CGRP)，CGRP 随后会通过 Rap1 介导的 mTOR-Raptor 相互作用的破坏来诱导癌细胞的细胞保护性自噬 (图 1)。抗糖酵解和抗血管生成的营养饥饿疗法都会加剧癌细胞和痛觉神经的这种恶性循环，从而导致痛觉神经成为癌症进展的微环境的帮凶。

保护性自噬：自噬是癌细胞进行抗癌治疗时的一种保护机制，能使癌细胞逃避凋亡。癌细胞对多种抗癌药物的耐药性可通过上调自噬而增加。

饥饿疗法：主要是通过阻断肿瘤的营养供应抑制肿瘤生长。治疗策略主要包括：靶向抑制促血管生成因子及其受体和整合素以抗肿瘤血管生成；抑制糖酵解、抑制氨基酸代谢等方式抑制肿瘤细胞代谢过程等。

图1. 该研究通路机制图

痛觉神经有助于 OSCC 肿瘤生长 ■ 痛觉神经存在于 TME 且促进 OSCC 进展作者通过对口腔鳞状细胞癌 (OSCC) 小鼠和病人的研究发现，与正常粘膜相比，不典型增生和浸润性癌中 TRPV1+ 痛觉神经密度更高 (图 2a)。降钙素基因相关肽 (CGRP) 通常被用作痛觉活性的分子指标，CGRP 在 OSCC 病人组织中的癌症相关痛觉神经中被检测到，并且 CGRP+ 痛觉神经比例越高的患者总生存率越低。然而癌细胞本身并不会表达 CGRP，癌症相关痛觉神经的高活性会导致 OSCC 患者的症状恶化，在 OSCC 进展中起到重要作用。为了进一步研究癌症相关痛觉神经对癌症进展的作用，作者在 BALB/c 裸鼠的舌粘膜下层 (该区域与痛觉神经轴突末梢在解剖学上相邻) 接种人 OSCC 细胞系 Cal27 或黑素瘤细胞系 B16F10 以建立骨科舌异种移植模型，这些模型中均检测到了神经生态位和高比例的 CGRP+ 神经，并且从第 8 天开始，小鼠血浆中鼠 CGRP 缓慢增加 (图 2b)，这意味着小鼠痛觉活性升高。在用辣椒素 (HY-10448) 对小鼠的痛觉神经进行化学去神经化后，Cal27 和 B16F10 肿瘤均变小了 (图 2c)。这些表明癌症相关痛觉神经有助于肿瘤生长。

图 2. 口腔黏膜癌存在于痛觉神经密度高的微环境 (TME) 中，有助于肿瘤生长

a: 4-**4NQO 诱导的小鼠 OSCC 泛神经 (PGP9.5+) 和痛觉神经 (TRPV1+PGP9.5+/PGP9.5+) 密度的定量分析 (Normal mucose: 正常粘液；Dysplasia：不典型增生；Invasive carcinoma：浸润性肿瘤); b: Cal27 异种移植小鼠在指定时间点血浆中的人鼠 CGRP 水平，鼠CGRP水平显著升高，人CGRP水平没有显著变化; c: Cal27 和 B16F10 异种舌移植体积，使用辣椒素 (Cap) 处理后肿瘤体积显著减小

■ 痛觉神经在低糖环境下促进癌细胞生长

葡萄糖和氨基酸等营养物质可以深刻影响 TME 中的癌细胞-基质/免疫细胞相互作用。在小鼠异种舌移植模型中，肿瘤组织中葡萄糖含量的下降与邻近正常组织相比明显更大，这表明肿瘤在口腔粘膜中快速消耗葡萄糖，同时该模型具有更高水平的应激反应蛋白和糖酵解酶 (图 3a)，高糖酵解活性可能有助于 OSCC 肿瘤的低糖环境。在低糖培养条件下用 TG CM (三叉神经节条件培养基) 培养时，所有三种肿瘤细胞系 (HN6、Cal27 和 B16F10) 的生长都得到了促进 (图 3b)。当癌细胞被给予 2-脱氧-D-葡萄糖 (2-DG, 用于模拟低糖环境) 时也观察到类似的效果。此外，在 Cal27 细胞中，TG CM 增加了增殖细胞核抗原 (PCNA) 的水平 (图 3c)。这些结果表明，在体外低糖环境下，痛觉神经促进癌细胞增殖。

在小鼠体内模型中，痛觉神经去神经化 (辣椒素处理，Cap dene) 减少肿瘤生长，瘤内葡萄糖含量的增加 (30% 葡萄糖水处理) 逆转了去痛觉神经化 (nociceptive denervation) 所介导的抗生长作用 (图 3d)。用辣椒素刺激痛觉神经，在低糖环境 (2-DG) 下显著促进肿瘤生长 (图 3e)。这些结果表明，痛觉神经也促进了体内低糖环境下癌细胞的生长。

图 3. 痛觉神经在低糖环境中促进癌细胞生长

a: 糖酵解和应激反应蛋白水平和组织葡萄糖含量的变化；b: HN6、Cal27 和 B16F10 细胞在指定培养条件下的生长 (n=3)；c: 在指定的培养条件下 24h 时，Cal27 细胞的 PCNA 和裂解的 caspase-3 蛋白水平；d-e: Cal27 异种舌移植模型中经不同处理后的肿瘤体积

神经源性 CGRP 对癌症发展的影响 ■ 在低葡萄糖环境中介导痛觉神经促进癌症发展

神经可以释放许多分子，包括代谢物、神经肽和核酸，以调节 TME。煮沸的 TG CM 会失去促进癌细胞生长的能力，而用 DNase 和 RNase 预处理的 CM 保留了其促进生长的作用，表明该生长促进作用并不是由核酸介导的。CGRP 通常被用作痛觉活性的分子指标，为了探究低葡萄糖环境中痛觉神经对癌细胞的生长促进作用是否由 CGRP 介导，作者用 Rimegepant (CGRP 受体拮抗剂) 阻断 CGRP 信号，发现 TG CM (添加三叉神经节的培养基) 介导的细胞生长被显著抑制 (图 4a)。用 siRNA 在 Cal27 细胞中敲低 CGRP 结合相关受体 (RAMP1 和 CLR) 也会抑制 TG CM 的促生长作用。

进一步的体内实验表明，在小鼠瘤内注射重组人 CGRP (rhCGRP) 可以拯救去痛觉神经化介导的 Cal27 肿瘤生长抑制 (图 4b)，在 Cal27 细胞中敲除 CLR 也会抑制辣椒素刺激的肿瘤细胞生长。这些结果表明，神经源性 CGRP 在低糖环境下介导痛觉神经对癌细胞的促生长作用。

图 4. 神经源性 CGRP 在低糖环境中介导痛觉神经对癌细胞的生长促进作用

a: 体外 Cal27 细胞在指定条件下处理 48 小时的生长情况；b: Cal27 异种舌移植模型肿瘤体积

■ 在人类 OSCC 进展过程中异常升高

为了研究神经源性 CGRP 在人类 OSCC 进展过程中的影响，作者对人类 OSCC 组织进行了组织学分析，发现在具有高 GCRP 神经生态位的近端肿瘤区域，癌细胞的比例更高。肿瘤组织中 CALCA (编码 CGRP) 水平较高的患者的生存率更低。与健康人相比，OSCC 患者术前血浆 CGRP 水平显著升高。CLR 水平越高，OSCC 患者的总体生存率越差。这些结果表明，神经源性 CGRP 及其受体 CLR 在 OSCC 进展过程中异常升高，并与较差的临床病理特征和患者结局相关。

■ 在低糖环境中诱导癌细胞保护性自噬

为了寻求低糖环境中痛觉神经和神经源性 CGRP 促进生长作用的机制，作者比较了与 rhCGRP 孵育或不孵育的 Cal27 细胞的转录组，以及在高糖培养或低糖培养下的转录组，发现仅在低糖培养下改变表达的基因与多种自噬途径显著相关。在低葡萄糖培养和 2-DG 处理下，用 TG CM 处理癌细胞可显著提高 LC3B-II 水平，降低 p62 水平(图 5a-b)。同样条件下用 rhCGRP 处理 Cal27 细胞也得到类似结果，并上调了Cal27 细胞中自溶酶体和自噬体的数量，这些增加的自噬通量都可以被 Rimegepant 拮抗。

通过敲低 ATG5 (在自噬形成过程中必不可少) 或 FIP200 (在自噬启动过程中必不可少) 抑制自噬通量可以显著拮抗 TG CM 介导的细胞生长促进 (图 5c)。在体内模型中敲低 ATG5 后，不管有没有 2-DG 处理，去痛觉神经化对细胞生长抑制均没有效果 (图 5d)。这些结果表明，在低葡萄糖环境中，痛觉神经促进的癌细胞生长依赖于自噬通量的增加。

图 5. 神经源性 CGRP 在低糖环境下通过诱导细胞保护性自噬促进癌细胞生长

a-b: 在指定培养条件下 24 h Cal27 细胞中 LC3B 和 p62 的水平及 LC3B-II 的净通量；c: 体外 Cal27 细胞在指定培养条件下生长 48 h (n = 3)；d: Cal27 异种舌移植模型在不同处理条件的肿瘤体积 (n = 4-5)

■ 上调 Rap1 介导的 mTOR Raptor 相互作用

研究发现，在低葡萄糖培养条件下 rhCGRP 孵育的 Cal27 细胞中，与 Rap1-GTPase 信号通路相关的基因明显上调，显著提高了 Rap1-GTP 水平，并激活了典型的下游ERK通路。通过敲除 Rap1B 来抑制 Rap1 激活能显著拮抗 CGRP 介导的自噬诱导，并增加 Cal27 细胞中的 PCNA (一种增殖标志物) 水平 (图 6a)。在 2-DG 处理的体内模型中，Rap1 的敲低消除了瘤内注射 rhCGRP 诱导的生长促进。这些结果表明，CGRP 诱导的癌细胞保护性自噬依赖于 Rap1-GTPase 信号通路的激活。

Rap1 的过度激活会使 mTOR 通路失活，而这种 mTOR 通路失活已知会激活自噬。作者发现 TG CM 在低糖培养和 2-DG 处理下抑制癌细胞中 mTOR 的磷酸化，这些作用可以被 Rimegepan 拮抗。Rap1 与 Raptor 相互作用，与 rhCGRP 孵育后这种相互作用增强 (图 6b)。Rap1 和 Raptor 之间的相互作用会阻碍 mTOR 和 Raptor 之间的相互作用，从而阻碍 mTOR 信号的激活 (图 6c)。这些结果表明，CGRP 介导的 Rap1 的激活通过破坏 mTOR Raptor 相互作用抑制了 mTOR 的磷酸化。

图 6. 神经源性 CGRP 通过 Rap1 介导的 mTOR Raptor 相互作用的破坏诱导癌细胞的细胞保护性自噬

a: 在指定的培养条件下 24 小时，Cal27 细胞 LC3B 和 p62 水平的变化; b, c: 在 Cal27 细胞中，Raptor 与 Rap1 以及 Raptor 与 mTOR 的相互作用

■ 在低糖环境下，癌细胞利用痛觉神经产生 CGRP

神经源性 CGRP 可以在低糖环境促进癌细胞生长，那么癌细胞是否可以反过来影响TME 中的痛觉神经呢？作者发现，与 Cal27 或 B16F10 细胞共培养可增加 TGs 中的 Calca (编码 CGRP) 水平，癌细胞的低葡萄糖培养和 2-DG 预处理也会增加 Calca 水平。在低糖培养和 2-DG 处理下，Cal27 和 B16F10 细胞中神经生长因子 NGF 水平显著升高。用 GW-441756 选择性抑制 NGF 受体不会影响 HN6、Cal27 或 B16F10 细胞的体外生长，但会拮抗癌细胞介导的 TGs 中 Calca 水平的升高。这些结果表明，癌细胞来源的 NGF 在低糖环境中促进痛觉神经 Calca 的转录，从而促进痛觉神经产生 CGRP。

作者进一步发现 c-Jun 是观察到的人类和小鼠 NGF/ NGF 转录诱导最有可能的调节因子 (图 7a)。JNK-c Jun 通路可被活性氧激活，Cal27 和 B16F10 细胞中低糖培养和 2-DG 处理后 ROS 水平升高，显著刺激 JNK-c-Jun 活性 (图 7b)，被激活的 c-Jun 定位于 Cal27 细胞的 NGF 位点 (图 7c)，过氧化氢酶预处理抑制了癌细胞 NGF 分泌升高 (图 7d)。这些结果表明，在低糖环境下，癌细胞分泌 NGF 依赖于 JNK-c-Jun 通路。

图 7. 在低糖环境下，癌细胞利用痛觉神经产生 CGRP

a: 确定 c-Jun 为人类和小鼠 NGF/ NGF 转录因子的候选因子；b: 在指定的培养条件下 2 h, 对 Cal27 细胞 JNK-c-Jun 通路的 IB 分析；c: 在指定培养条件下，在 Cal27 细胞 NGF 启动子上进行 c-Jun 的 ChIP-qPCR 检测；d: 在指定培养条件下 24 h，Cal27 细胞分泌 NGF 的情况 (n = 3)

总结

在低糖环境中观察到的癌细胞和痛觉神经之间的双向相互作用表明，打破这种恶性循环可能会增强营养饥饿疗法的治疗效果。在两类营养饥饿疗法：糖酵解抑制剂和血管生成抑制剂中，都增加了舌异种移植中的 NGF 水平，增加了 TGs 中 CGRP 含量的上调。将营养饥饿疗法药物与 Rimegepant 联用破坏癌细胞和伤害神经之间的相互作用，可以有效地增强营养饥饿疗法的抗肿瘤疗效。

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参考文献

Zhang Y, et al. Cancer cells co-opt nociceptive nerves to thrive in nutrient-poor environments and upon nutrient-starvation therapies. Cell Metab. 2022 Dec 6;34(12):1999-2017.e10.