超嗜热酶：来源、用途和热稳定性的分子机制

Abstract

Enzymes synthesized by hyperthermophiles (bacteria and archaea with optimal growth temperatures of >80°C), also called hyperthermophilic enzymes, are typically thermostable (i.e., resistant to irreversible inactivation at high temperatures) and are optimally active at high temperatures. These enzymes share the same catalytic mechanisms with their mesophilic counterparts. When cloned and expressed in mesophilic hosts, hyperthermophilic enzymes usually retain their thermal properties, indicating that these properties are genetically encoded. Sequence alignments, amino acid content comparisons, crystal structure comparisons, and mutagenesis experiments indicate that hyperthermophilic enzymes are, indeed, very similar to their mesophilic homologues. No single mechanism is responsible for the remarkable stability of hyperthermophilic enzymes. Increased thermostability must be found, instead, in a small number of highly specific alterations that often do not obey any obvious traffic rules. After briefly discussing the diversity of hyperthermophilic organisms, this review concentrates on the remarkable thermostability of their enzymes. The biochemical and molecular properties of hyperthermophilic enzymes are described. Mechanisms responsible for protein inactivation are reviewed. The molecular mechanisms involved in protein thermostabilization are discussed, including ion pairs, hydrogen bonds, hydrophobic interactions, disulfide bridges, packing, decrease of the entropy of unfolding, and intersubunit interactions. Finally, current uses and potential applications of thermophilic and hyperthermophilic enzymes as research reagents and as catalysts for industrial processes are described.

摘要

由超嗜热菌（最佳生长温度 >80°C 的细菌和古细菌）合成的酶，也称为超嗜热酶，通常是热稳定的（即，在高温下抵抗不可逆失活）并且在高温下具有最佳活性。这些酶与其嗜温对应物具有相同的催化机制。当在嗜温宿主中克隆和表达时，超嗜热酶通常会保留其热特性，表明这些特性是基因编码的。序列比对、氨基酸含量比较、晶体结构比较和诱变实验表明，超嗜热酶确实与其嗜温同系物非常相似。没有单一的机制是造成超嗜热酶显着稳定性的原因。相反，必须在少数高度特异性的改变中发现增加的热稳定性，这些改变通常不遵守任何明显的交通规则。在简要讨论了超嗜热生物的多样性后，这篇综述集中讨论了它们酶的卓越热稳定性。描述了超嗜热酶的生化和分子特性。回顾了导致蛋白质失活的机制。讨论了蛋白质热稳定所涉及的分子机制，包括离子对、氢键、疏水相互作用、二硫键、堆积、去折叠熵降低和亚基间相互作用。最后，描述了嗜热和超嗜热酶作为研究试剂和工业过程催化剂的当前用途和潜在应用。

介绍

超嗜热菌在 80 到 110°C 之间的温度下生长最佳。这些生物仅以细菌和古细菌物种为代表，已从所有类型的陆地和海洋热环境中分离出来，包括自然和人造环境。来自这些生物体的酶（或超嗜热酶）在 70°C 以上的温度下具有高热稳定性和最佳活性的独特结构-功能特性。其中一些酶在高达 110°C 及以上的温度下仍具有活性（349). 嗜热生物在 50 到 80°C 之间生长最佳。它们的酶（嗜热酶）显示出介于超嗜热酶和嗜温酶之间的热稳定性能。这些嗜热酶通常在 60 至 80°C 之间具有最佳活性。在高温下活跃，嗜热和超嗜热酶通常在 40°C 以下不能很好地发挥作用。

目前的理论和环境证据表明，超嗜热生物是地球上最早出现的生命形式 ( 318 )。因此，超嗜热酶可以作为模型系统供有兴趣了解酶进化、蛋白质热稳定性的分子机制和酶功能的温度上限的生物学家、化学家和物理学家使用。这些知识可以导致开发新的和/或更有效的蛋白质工程策略和广泛的生物技术应用。

本综述将涵盖嗜热和超嗜热酶的来源和用途，以及蛋白质稳定性的分子决定因素。重点将放在超嗜热酶上，因为目前大多数研究都集中在这些酶和超嗜热菌上。生命的最高温度是多少？早在 1969 年，当 TD Brock 及其同事发现Thermus aquaticus（现在以PCR 技术中的Taq聚合酶而闻名）时， T. aquaticus被认为是极端嗜热菌，因为它在 75°C 下生长最佳 ( 41 )。当然，如今，生长温度高达 113°C ( 28 ) 的超嗜热生物，如Pyrolobus fumarii ，被认为是极端的。

嗜热酶和超嗜热酶（也称为嗜热酶 [参见参考文献349 ]）是另一种称为极酶的酶类的一部分，它在极端微生物中进化。极酶可以在高盐水平（盐酶）、高碱性条件（碱酶）和其他极端条件（压力、酸度等）下发挥作用（参见参考文献4、144、223和371). 嗜热和超嗜热酶在高温下具有本质稳定性和活性，与嗜温酶相比具有重要的生物技术优势。（即酶在 25 至 50°C 下具有最佳活性）或嗜冷酶（即酶在 5 至 25°C 下具有最佳活性）：(i) 一旦在嗜温宿主中表达，嗜热和超嗜热酶更容易通过热处理纯化，（ii）它们的热稳定性与对化学变性剂（例如溶剂或盐酸胍）的更高抵抗力相关，并且（iii）在高温下进行酶促反应允许更高的底物浓度，更低的粘度，更少的微生物污染风险，和通常反应速率较高。

超嗜热菌已经成为广泛评论 ( 140 , 317 , 319 , 320 )的对象，此处仅作简要描述。没有对从嗜热菌和超嗜热菌中分离和表征的所有酶进行详尽描述，因为该信息可在别处获得 ( 2 , 3 , 139 , 263 , 349 )。相反，我们将关注解释极端蛋白质热稳定性的分子决定因素的最新发现，以及具有最高商业相关性的嗜热和超嗜热酶。

超嗜热菌多样性

在过去的 30 年里，科学界对嗜热菌的兴趣不断增加。这种日益增长的兴趣体现在已被描述的超嗜热物种数量的增加（从 1972 年的 2 个 [ 40 , 372 ] 到 1999 年底的 70 多个 [ 140 , 320 ]），关于主题，以及全球基因组测序项目中嗜热菌占据的主要中心位置（六个完整的基因组序列，以及至少四个正在进行的基因组测序项目）（见表的表格11个和http://www.tigr.org ）对源自单一大陆温泉（黄石国家公园的黑曜石池）的样本中的环境 16S rRNA 序列 ( 18 , 19 ) 和环境脂质分析 ( 128 ) 的研究表明，已知的嗜热菌仅代表超嗜热物种多样性的一小部分。

既然我们能够几乎常规地从深海海底采集样本，那么接触超嗜热生境就不再是研究超嗜热生物多样性的限制因素。分离和培养新的超嗜热菌的纯培养物一直是——而且仍然是——一个挑战。这种困难的一个显着例子是细菌Thermocrinis ruber ( 147 )。Brock ( 39 )早在 1967 年就描述了这种形成粉红色细丝的细菌，但成功培养这种生物体 ( 147 )花费了超过 25 年的时间。在不久的将来，科学家的一项主要任务将是为具有不同的、不可预见的代谢要求的微生物开发新的分离技术。胡贝尔等。( 145) 率先使用光学镊子克隆了一种新的古菌超嗜热菌。

超嗜热菌几乎完全从温度范围为 80 至 115°C 的环境中分离出来。热的自然环境包括大陆 solfataras、深层地热加热含油层、浅海和深海热沉积物，以及位于海平面以下 4,000 米的热液喷口（表的（表格1）。1个). 超嗜热菌也已从高温工业环境中分离出来（例如，地热发电厂和污水污泥系统的流出物）。深海超嗜热生物在静水压力为 200 至 360 atm 的环境中茁壮成长。其中一些物种具有耐压性 ( 281 ) 甚至嗜压性 ( 95 , 233 , 257 )。已知最嗜热的生物，P. fumarii, 在 90 至 113°C 的温度范围内生长。可能存在生命的最高温度仍然未知，但可能不会超过 113°C。高于 110°C，氨基酸和代谢物等分子变得高度不稳定（ATP 在低于 140°C 的温度下在水溶液中自发水解）并且疏水相互作用显着减弱（163 ）。

在已描述的超过 70 个物种、29 个属和 10 个嗜热菌目中 ( 320 )，大多数是古细菌。Thermotogales和Aquificales是唯一的细菌（表的（表格1）。1个). Thermotogales和Aquificales是细菌谱系中最深的分支，因此它们代表了进化研究中明显的兴趣 ( 1 )。从完整的海栖热袍菌基因组序列中提取的最引人注目的发现之一( 258 ) 是支持古细菌和细菌之间横向基因转移的大量证据：(i) 24% 的海栖热袍菌开放阅读框（Aquifex中为 16%）风生菌) 编码的蛋白质更类似于古细菌而不是细菌蛋白质；(ii) 这些古细菌样基因在生物类别中分布不均；(iii) 这些基因中的 81 个聚集在 15 个 4 到 20 kb 的区域，其中的基因顺序可以与古细菌中的相同；(iv) T. maritima基因组序列不具有均一的 G+C 含量——在 G+C 含量显着不同的 51 个区域中，42 个包含“类古生菌”基因。

到目前为止，古菌域由两个分支组成：Crenarchaeota和Euryarchaeota。最近对从超嗜热环境中分离出来的 16S rRNA 进行了测序，它与任何其他古细菌 rRNA 都不相关。这种新的 rRNA 物种表明在古细菌域中存在第三个分支，即Korarcheota，它在古细菌树中的分支比Crenarchaeota和Euryarchaeota更深( 18 )。超嗜热菌以Crenarchaeota和Euryarchaeota为代表，它们系统地代表了这两个分支中最深和最短的谱系（参见参考文献140和320系统发育树）。除了嗜热嗜酸菌外，Crenarchaeota还包括嗜盐菌。在广古菌中，产甲烷菌有嗜温亲属。

超嗜热菌群落是有机物初级生产者和分解者的复杂系统。所有超嗜热初级生产者都是化能自养生物（即，硫氧化剂、硫还原剂和产甲烷菌）( 104 , 223 )。与大多数高温自然生境的高硫含量相关，大多数超嗜热生物是兼性或专性化能无机生物：它们要么用H 2还原 S 0以产生 H 2 S（厌氧菌），要么用 O 2氧化 S 0以产生硫酸（需氧菌）。极端嗜酸的超嗜热菌属于硫化叶菌目。它们都是严格的需氧菌（例如，Sulfolobus) 或兼性需氧菌（例如Acidianus），它们几乎完全从大陆 solfataras 中分离出来（表的（表格1）。1个). 虽然大多数异养生物是专性硫还原者，但Thermotogales的所有成员以及Pyrococcales和Thermococcales的大多数成员都可以独立于 S 0生长，从发酵中获取能量（表的（表格1）。1个). 由于其海底环境的有机物含量极低，超嗜热异养生物通常从初级生产者分解产生的复杂肽混合物中获取能量和碳。一些物种能够使用多糖（例如，淀粉、果胶、糖原和几丁质）；迄今为止，Archeoglobus profundus是唯一已知的使用有机酸的物种。

超嗜热酶的生化和分子特性

热和催化性能

高温下的热稳定性和最佳活性是超嗜热酶的固有特性。酶的热稳定性包括热力学和动力学稳定性。热力学稳定性由酶的稳定自由能 (Δ G stab ) 和解链温度 ( T m，50% 的蛋白质展开时的温度) 定义。对于不可逆展开的酶，只能确定Tm 。动力学稳定性取决于展开的能垒（即展开的活化能 [ E a ]）。酶的动力学稳定性通常表示为其半衰期 ( t 1/2) 在规定的温度下。在这篇综述中，如果一种酶来自嗜温生物，则称为嗜温酶；如果来自嗜热菌，则称为嗜热酶；如果来自超嗜热菌，则称为超嗜热酶。此外，如果酶 X 在比酶 Y 更高的温度下具有最佳活性，我们将说酶 X 比酶 Y 更嗜热。

大多数以超嗜热菌为特征的酶在接近宿主生物的最佳生长温度（通常为 70 至 125°C）的温度下具有最佳活性（有关纯化的超嗜热酶及其特性的列表，请参见参考文献139和349 ）。细胞外和细胞结合的超嗜热酶（即糖酶和蛋白酶）在高于（有时远高于）宿主生物体的最适生长温度的温度下具有最佳活性，并且通常高度稳定。例如，Thermococcus litoralis支链淀粉酶在 117°C 时具有最佳活性，比生物体的最佳生长温度 88°C 高 29°C ( 43). 虽然它们通常不如从同一宿主中纯化的细胞外酶那么嗜热，但细胞内酶（例如木糖异构酶）通常在生物体的最佳生长温度下具有最佳活性。只有少数酶被描述为在低于生物体最适生长温度 10 至 20°C 时具有最佳活性 ( 108 , 197 , 278 )。虽然大多数超嗜热酶本质上非常稳定，但一些细胞内酶的高热稳定性来自细胞内因素，例如盐、高蛋白质浓度、辅酶、底物、活化剂或一般稳定剂（如热胺）。

超嗜热和超嗜温酶的 Arrhenius 图通常是线性的 ( 20 , 29 , 62 )，这表明嗜温和超嗜热酶的功能构象在其各自的温度范围内保持不变。如果酶结构随着温度的升高而发生显着的催化变化，人们会期望找到 (i) 大多数酶的非线性 Arrhenius 图和 (ii) 不同类型酶的不同类型的图。报道了一些超嗜热酶的双相 Arrhenius 图（58 , 98 , 101 , 133 , 366) 代表了典型的类 Arrhenius 行为的一个重要例外。双相 Arrhenius 图通常可以与功能显着的构象变化相关联，通过光谱方法检测 ( 101 , 133 , 222 )。虽然通常没有太多关于温度对嗜温酶活性影响的信息，但存在一些嗜温酶显示弯曲的阿伦尼乌斯图 (110 )的例子，表明这种不连续性不是超嗜温酶的特定特征。

超嗜热蛋白与其嗜温同系物高度相似

除了系统发育变异外，超嗜热酶和嗜温酶的区别仅在于它们稳定和活跃的温度范围。否则，超嗜热酶和嗜温酶高度相似：(i) 同源超嗜热蛋白和嗜温蛋白的序列通常有 40% 到 85% 的相似性 ( 79 , 350 )；(ii) 它们的三维结构是可叠加的（16 , 63 , 143 , 160 , 227 , 284 , 327）；( iii) 它们具有相同的催化机制（ 22、350、386 ）。

嗜热菌基因的克隆和表达（这部分没有翻译，大概是报道的嗜热酶都能在嗜温环境中表达，不清楚是否所有，90%原本的特性不变，10%特性不同）

刚性和热稳定性

目前的一个工作假设是，在嗜温温度下，超嗜热酶比它们的嗜温同系物更坚硬，而刚性是高蛋白质热稳定性的先决条件。这一假设得到越来越多实验数据的支持，包括频域荧光和各向异性衰减 ( 229 ) 、氢-氘交换 ( 35、164、370 ) 和色氨酸磷光 ( 114 ) 实验。数字的图11个说明了氢-氘交换实验之一。在 20°C 时，酸热硫化叶菌腺苷酸激酶中的酰胺质子比例(53%) 比猪胞质酶 (83%) 中交换的要少得多，这表明相当多的酰胺质子参与了嗜热酶中的稳定氢键. 需要 80 到 90°C 的温度，S. acidocaldarius腺苷酸激酶才能显示出与具有催化活性的嗜温酶相当的交换水平 ( 35 )。在蛋白质结构测定中，原子温度因子提供了局部灵活性的充分表示。在 1987 年的一项研究中，Vihinen ( 351) 从归一化原子温度因子开始计算嗜温和嗜热蛋白质的蛋白质灵活性指数。他的结果表明，随着热稳定性的增加，柔韧性降低。这项研究需要更新，因为 Vihinen 的样本很小并且不包括关于超嗜热蛋白的数据。计算机模拟表明，在皮秒时间尺度上，嗜温的红素氧还蛋白在室温下比其P. furiosus同系物更灵活( 201 )。

虽然大多数嗜温蛋白和超嗜热蛋白的灵活性比较都得出了相同的结论，即超嗜热蛋白是更刚性的酶，但最近的一项研究 ( 134 ) 不支持这一结论。使用酰胺氢交换数据，Hernández 等人。显示 (i)在接近P. furiosus 的温度下，所有涉及P. furiosus红氧还蛋白的酰胺氢的氢键在不到 1 秒的时间内被破坏红素氧还蛋白的最大热力学稳定性温度；(ii) 溶剂通道的构象开放发生在整个蛋白质的毫秒范围内；(iii) 在碱性 pH 值下，氢键酰胺贡献的最大焓占通常与蛋白质展开相关的总活化焓的不到 5%。这些结果表明，迄今为止表征的最稳定的蛋白质显示出一定程度的构象灵活性，可与嗜温蛋白质相媲美。

拉扎里迪斯等人。( 201 ) 认为没有单一的灵活性衡量标准（蛋白质可以在纳秒尺度上是刚性的，但在毫秒尺度上是柔性的）并且稳定性和刚性之间没有相关的根本原因。柔韧性意味着折叠状态的构象熵增加，因此有利于热力学稳定性。在我们更好地了解构象刚性在蛋白质稳定性中的作用之前，需要对不同温度下的超嗜热酶灵活性进行更多研究。

也有人提出，过度的刚性解释了为什么超嗜热酶在低温（即约 20 至 37°C）下通常不活跃。倾向于支持这一假设的一组证据是变性剂（例如盐酸胍和尿素）（23、195、364）、洗涤剂（例如Triton X - 100和十二烷基硫酸钠）（82、283、290）、和溶剂 ( 78 , 195 ) 通常会在次优温度下激活超嗜热酶。随着温度接近酶的最大活性温度 ( T opt ) ( 23). 在那个温度下，酶在没有变性剂的情况下足够灵活以显示出全部活性。最近的研究结果表明，随着温度的升高，嗜热乙醇脱氢酶中的氢隧道效应水平会增加，这为热诱导蛋白质运动在调节酶活性中的作用提供了额外的证据 (190 )。一些超嗜热酶的特点是比它们的嗜温对应物更活跃，即使在 37°C ( 156 , 246 , 315). 由于它们是热稳定的，因此预计这些酶在中温温度下会非常坚硬。它们在中温温度下的高催化活性表明这些酶结合了其活性位点的局部灵活性（这是它们在低温下的活性）和高整体刚性（这是它们的热稳定性的原因）。这种酶的存在（以及高度稳定的工程嗜温酶 [ 116 , 374]) 还表明热稳定性与中等温度下的高活性并不矛盾。超嗜热菌可能只需要在最佳温度下具有与其嗜温同系物相当的活性的酶。虽然生物体可能没有进化压力来拥有更高效的酶，但这并不意味着不能在实验室中设计出更高效的耐热酶。

嗜热与超嗜热蛋白质和稳定自由能

蛋白质的稳定自由能（Δ G stab，其中 Δ G stab = Δ H stab − T Δ S stab）是该蛋白质折叠和展开状态的自由能之差。它直接测量折叠蛋白质的热力学稳定性。Δ H stab（稳定化焓）和 Δ S stab（稳定化熵）在大多数酶的活性温度范围内都是大数，几乎随温度线性变化。也是温度的函数，ΔG stab通常很小 ( 83 ,162）（表的（表3）。3个). 25°C时，球状嗜温蛋白的ΔG稳定值通常在 5 到 15 kcal/mol 之间（表的（表3）。3个). 没有多少蛋白质被研究来确定稳定的自由能。大多数蛋白质的热变性是不可逆的这一事实阻碍了此类研究：完全变性通常几乎立即发生聚集和沉淀（见下文）。因此，大多数 ΔG stab数据是针对小的单体蛋白质 ( 277 )（表的（表3）。3个). 对于超嗜热蛋白， ΔG stab计算变得更加困难，因为它们的变性转变发生在大多数量热计的温度范围之外 ( 141 , 274 )。为了克服这个困难，大多数超嗜热蛋白质稳定性的热力学研究是在盐酸胍存在下 ( 168 ) 或在生理条件之外的 pH 下进行的 ( 241)). 这些不同的条件允许变性转变的温度变得易于物理测量，并且在某些情况下它们允许酶可逆地展开。在一种情况下，超嗜热蛋白的稳定性参数是在天然条件下使用氢交换来测量天然和未折叠蛋白之间的可逆循环来确定的 ( 141 )。桌子的表33个显示在大多数情况下，超嗜热蛋白和嗜温蛋白的ΔG stab值差异很小，通常在 5 至 20 kcal/mol 的范围内。酶突变体的稳定性研究 ( 173 , 261 )，表明小至 3 至 6.5 kcal/mol 的Δ G stab差异可以解释高达 12°C 的热稳定性增加，与表中列出的稳定性数据完全一致的表3。3个.

由于在超嗜热蛋白中发生的焓和/或熵稳定，该蛋白的 ΔG stab - versus- T曲线将不同于其嗜温对应物。数字的图22个说明了可以实现增加的蛋白质热力学稳定性的三种理论方法 ( 265 )：(a) 超嗜热蛋白质的 ΔG stab与T曲线可以向更高的ΔG stab值移动，(b) 它可以是向更高的温度移动，或者 (c) 它可以变平（由于蛋白质折叠和展开状态之间的部分摩尔热容差异较小 [Δ C p ]）。如表所示的表3，3个, 大多数嗜热和超嗜热蛋白使用这三种机制的各种组合来达到其卓越的热力学稳定性。例如，与ΔG stab -vs- _ _ _ _ _ _ _ _甲烷杆菌组蛋白的T曲线。嗜热蛋白和超嗜热蛋白之间最常见的稳定机制是它们的 Δ G stab相对于T的变化曲线朝向更高的 Δ G stab值。

蛋白质失活机制

展开、乱序结构的形成和聚合

天然的活性蛋白质通过非共价力（例如，H 键、离子对以及疏水性和范德华力相互作用）的微妙平衡结合在一起。当高温破坏这些非共价相互作用时，蛋白质展开。可以通过不同的技术观察蛋白质展开，包括差示扫描量热法、荧光、圆二色谱、粘度和迁移模式。通过量热法和光谱技术确定的 T m 通常是相同的( 216 )。大量研究表明，失活仅在低于Tm几度时变得显着. 在大多数情况下，二级和三级结构的丢失伴随着高温下酶的失活。小单体蛋白通常通过双态转换展开（即，展开的中间体几乎检测不到或检测不到）。一些蛋白质可能会在冷却后恢复其天然的活性构象。这种展开称为热力学可逆展开，可以确定描述折叠和展开状态的热力学参数（使用量热数据最容易完成）( 17 , 277 )。

（太多了后面只翻译我需要的部分）

肽键的水解。

肽键的水解最常发生在 Asp 残基的 C 端侧，Asp-Pro 键是所有键中最不稳定的 ( 354 )。有两个因素似乎是造成这种不稳定性的原因。脯氨酸氮比其他残基更碱性，当连接在脯氨酸的 N 侧时，Asp 具有增加的 α-β 异构化倾向。肽链裂解也可以发生在 Asn-Xaa 连接处，以类似 β-天冬氨酰转移的机制 ( 367 )。在该反应中，Asn 氨基 (-NH 2 ) 基团充当亲核试剂，攻击其自身的主链羧基碳（图 1）。的(图3)3个) ( 132 ). 当条件有利于展开时（即温度高于 85°C 和低盐浓度），这种裂解发生在M. fervidus GAPDH 的五个位置。不易受水解影响，更耐热的P. woesei GAPDH 在其中三个切割位置包含替换。余下的两个 Asn-Xaa 位点的切割可能被P. woesei酶的较高构象刚性所抑制。

半胱氨酸氧化。

半胱氨酸是蛋白质中反应性最强的氨基酸。它们的自氧化通常由金属阳离子（尤其是铜）催化，导致分子内和分子间二硫键的形成或亚磺酸的形成（354）。半胱氨酸还可以催化二硫键交换，导致二硫键重组以及重要的结构变化。重组的S. solfataricus 5'-甲基硫代腺苷磷酸化酶形成不正确的亚基间二硫键，使其稳定性和嗜热性低于天然酶

其他反应。

除了上述常见的降解反应外，还发现了其他不太常见的化学失活机制（354）。甲硫氨酸可被氧化为其亚砜对应物，并且一些残基（尤其是 Asp 和 Ser）可外消旋化为其d型。赖氨酸可以通过美拉德反应 ( 279 ) 与还原糖发生反应。最后，类嗜热菌蛋白酶的中性蛋白酶容易自溶。它们表面环之一的局部展开决定了它们通过自溶失活 ( 93 )。

蛋白质热稳定的机制

疏水效应被认为是蛋白质折叠的主要驱动力 ( 83 )。疏水性驱使蛋白质形成折叠结构，从该结构开始，天然结构由所有类型的力（例如，H 键、离子对和范德瓦尔斯相互作用）的贡献来定义。莳萝 ( 83) 回顾了支持该理论的证据：(i) 非极性溶剂使蛋白质变性；(ii) 疏水残基通常被隔离在核心中，在那里它们基本上避免与水接触；(iii) 蛋白质核心中的残基和疏水性比任何其他类型的残基更保守并且与结构相关（核心疏水性残基的替换通常比其他类型的替换更具破坏性）；(iv) 蛋白质展开涉及热容量的大幅增加。鉴于疏水效应在蛋白质折叠中的核心作用，很容易假设疏水效应也是影响蛋白质稳定性的主要力量。过去 20 年积累的测序、结构和诱变信息证实，疏水性确实是蛋白质稳定性的主要力量。两项观察表明，嗜温和超嗜热同系物具有由保守蛋白核心提供的共同基本稳定性：(i) 二级结构中涉及的疏水相互作用和核心残基比表面积特征更保守，以及 (ii) 在中发现了许多稳定取代溶剂暴露区域（如在嗜温和超嗜热蛋白质结构比较和蛋白质定向进化实验中观察到的，见下文）。在嗜温和超嗜热蛋白同源物的核心中遇到的高度相似性表明，即使是嗜温蛋白也几乎尽可能有效地包装并且在蛋白质核心内部没有太多空间用于稳定。超嗜热蛋白中的稳定相互作用通常出现在蛋白质不太保守的区域。如下图所示，表面离子对、暴露于溶剂的疏水表面减少以及“松散末端”（即 N 和 C 末端和环）锚定到蛋白质表面等因素似乎有助于超嗜热蛋白质的热稳定性。

近年来，在超嗜热蛋白上积累了足够的实验证据（例如，序列、诱变、结构和热力学），可以得出结论，没有单一机制可导致超嗜热蛋白的显着稳定性。相反，必须在少数通常不遵守任何明显交通规则的高度特异性突变中发现增加的热稳定性。

氨基酸组成和内在倾向

长期以来，人们一直认为蛋白质的氨基酸组成与其热稳定性有关。比较嗜温蛋白和嗜热蛋白中的氨基酸组成的第一项统计分析表明了 Gly→Ala 和 Lys→Arg 等取代趋势。嗜热蛋白中较高的丙氨酸含量被认为反映了 Ala 是最好的螺旋形成残基这一事实 ( 10 )。随着更多实验数据的积累（特别是完整的基因组序列），越来越明显的是“嗜热适应的交通规则不能根据氨基酸组成的显着差异来定义”（31). 基于八个嗜温和七个嗜热生物的基因组序列比较嗜热和嗜温蛋白质中的残留量仅显示出较小的趋势（表的（表 4）。4个). 在超嗜热蛋白中发现的带电残基 (+3.24%) 多于在嗜温蛋白中，主要是以不带电的极性残基 (-4.98%；特别是 Gln，-2.21%) 为代价。超嗜热蛋白还含有比嗜温蛋白略多的疏水性和芳香族残基。这些从基因组测序获得的数据不能一概而论，因为超嗜热菌基因组本身存在很大差异：Aeropyrum pernix蛋白质库实际上包含较少的带电残基 (23.64%)、较少的大疏水残基 (27.29%) 和较少的芳香族残基 (7.42%) ) 比表中列出的嗜温菌的表 4。4个. 相反，A. pernix蛋白质含有更多的 Ala、Gly、Pro、Ser 和 Thr 残基。因此，超嗜热蛋白氨基酸组成的偏差通常可能与进化相关，而不是其适应高温的迹象。与氨基酸组成相比，与热稳定性更相关的可能是残基的分布及其在蛋白质中的相互作用。解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN' 和Thermoactinomyces vulgaris铝热酶这两种同源蛋白酶含有相同数量的带电残基，但嗜热酶铝热酶含有多八个离子对 ( 331 )。

关于蛋白质稳定性由其核心的稳定性和紧密堆积决定的想法，研究了单个残基参与螺旋或链结构的倾向作为潜在的稳定性机制。在他们对嗜温和嗜热蛋白质结构的比较中，Facchiano 等人。( 99 ) 观察到嗜热蛋白的螺旋通常比嗜温蛋白的螺旋更稳定。他们检测到的唯一趋势是嗜热蛋白螺旋中 β-支链残基（Val、Ile 和 Thr）含量下降（β-支链残基在螺旋中的耐受性不如线性残基）(99 )。存在许多未遵循此趋势的示例。P. furiosus和T. litoralis GDHs 含有大量的异亮氨酸。如果比较 Leu 和 Ile 残基，这两个残基具有最高（和等效）的部分比容。在蛋白质中，Leu 侧链最常见于两种旋转异构体构象之一（χ1 为 180° 和 300°），但不存在于 χ1 = 60° 的构象中。Ile 侧链经常采用四种不同的旋转异构体构象，并发现了三个 χ1 值。凭借这种构象灵活性，Ile 可能能够更好地填充蛋白质核心包装过程中可能出现的各种空隙 ( 38 )。莳萝 ( 83) 还指出，背景效应（例如，盐桥形成、芳香族相互作用、疏水表面的掩埋和空腔填充）可能与固有螺旋倾向一样重要。在许多情况下，蛋白质结构中发现的二级结构与内在倾向预测的二级结构不对应，这表明内在倾向不足以解释蛋白质中 α-螺旋的稳定性 (83 )。

Arg 残基的几个特性表明它们比 Lys 残基更适合高温：Arg δ-胍基部分由于其高 pKa 和共振稳定性而具有降低的化学反应性。δ-胍基部分为带电相互作用提供了比赖氨酸氨基更大的表面积。数字的图44个说明了 Arg 参与多种非共价相互作用的能力。由于 Arg 侧链所含的亚甲基比 Lys 少一个，因此它有可能与溶剂形成较少的不利接触。最后，因为它的 pK a（大约 12）比 Lys（11.1）高 1 个单位，Arg 在高温下更容易保持离子对和净正电荷（pK a值随着温度升高而下降）（252、354） . 表中列出的嗜温菌和超嗜热菌的蛋白质池中的平均 Arg/Lys 比率的表44个（分别为 0.73 ± 0.37 和 0.87 ± 0.60）与较大的标准偏差相关。（在超嗜热菌中，Arg/Lys 比率从Aquifex aeolicus蛋白中的 0.52 到Aeropyrum pernix蛋白中的 2.19不等。）这些结果表明，如果增加的 Arg 含量确实起到了稳定作用，那么这种机制并未在超嗜热菌中普遍使用。

脱酰胺影响超嗜热蛋白 ( 156 ) 的一个间接迹象是T. maritimal l-异天冬氨酰甲基转移酶的高活性。该酶甲基化由 Asn 脱酰胺或 Asp 异构化产生的l -isoasp 残基。它的高活性表明它已经适应了可能在高温下发生的高负荷蛋白质损伤。对脱酰胺的抗性似乎是由至少三种适应机制引起的。(i) 一些超嗜热酶所含的 Asn 少于它们的嗜温同系物。P. woesei 3-磷酸甘油酸激酶 (PGK) 含有比布氏甲烷杆菌更少的 Asn酵素呢。在 Asn-Ala 和存在于M. bryantii PGK中的三个 Asn-Gly 序列中的两个中，Asn 残基在P. woesei酶中被取代 ( 136 )。唯一保守的 Asn-Gly 序列在所有 PGK 中都是保守的。这四个非保守序列可能在高温下易受脱酰胺作用影响，并且在超嗜热性 PGK 中已被选择反对。ii 型d-木糖异构酶中的 Asn+Gln 含量与其各自的最大活性温度（范围为 55 至 95°C）之间也显示出直接相关性 ( 350). (ii) 其他超嗜热酶含有同样多的 Asn 残基，但这些残基位于不易脱酰胺的位置和构象中。P. woesei GAPDH 对脱酰胺和肽键水解的抗性被证明与酶的较高构象稳定性有关 ( 132 )。S. solfataricus 5'-甲硫腺苷磷酸化酶在 120°C 下具有最佳活性，其Tm为 132°C。在 100°C ( 52 )下 2 小时后它不会失活。有趣的是，它所含的 Asn 是大肠杆菌相关酶的两倍，包括序列 Asn-Gly 中的一个 Asn，该序列通常对脱酰胺作用高度敏感。

Asn和Gln含量见表的表44个表明超嗜热蛋白不会仅通过降低 Asn 含量来获得对脱酰胺的抗性。相反，令人好奇的是，七种超嗜热菌在其蛋白质中显示出同样显着的 Gln 残基减少。

半胱氨酸在高温下对氧化的高度敏感性表明，超嗜热酶所含的半胱氨酸少于它们的嗜温酶。而表的表44个表明超嗜热蛋白平均含有比嗜温蛋白更少的半胱氨酸，物种之间存在很大差异。事实上，Archaeoglobus fulgidus和Methanococcus jannaschii蛋白质含有更多的半胱氨酸（分别为 1.17 和 1.27%），高于平均嗜温菌蛋白质库（1.10%）。来自表中的七种超嗜热生物的表 4,4个, A. aeolicus和A. pernix分别是微需氧菌和嗜氧菌，而其他的是严格厌氧菌。有趣的是，A. aeolicus和A. pernix蛋白质含有比Pyrococcus abyssi、P. horikoshii和T. maritima更多的半胱氨酸（分别为 0.79 和 0.93%）蛋白质确实如此（分别为 0.55、0.63 和 0.71%）。人们会预料到来自好氧超嗜热菌的蛋白质中存在半胱氨酸的高选择压力（以及厌氧超嗜热菌中不存在这种选择压力）。来自好氧超嗜热菌的蛋白质中存在的半胱氨酸通常参与特定的稳定相互作用（例如，二硫键和金属配体）和/或溶剂无法接近。10 mM 二硫苏糖醇需要剧烈的变性条件（在 70°C 下 2 小时，存在 6 M 盐酸胍）以减少天然硫磺酸链霉菌 5'-甲硫腺苷磷酸化酶 (51) 中六个亚基间二硫键中的大部分。相反，来自厌氧菌T. maritima的 GAPDH包含三个 Cys 残基，其中一个在活性位点中必不可少，另外两个由 Schultes 等人描述。作为“不必要的”（299）。

二硫键

二硫键被认为主要通过熵效应稳定蛋白质，通过降低蛋白质未折叠状态的熵 ( 237 )。二硫键的熵效应与分隔桥接的两个半胱氨酸的残基数量的对数成正比。

由于半胱氨酸和二硫键在高温下容易被破坏，因此 100°C 被认为是含有二硫键的蛋白质稳定性的上限 (353 )。这个概念是基于这样一个事实，即早期表征蛋白质失活机制的研究是用当时唯一可用的酶进行的：嗜温酶。这些研究确定，所研究的所有含有二硫键的蛋白质在 100°C 时具有相同的 β-消除率。该速率与蛋白质结构无关，并且在 pH 8.0 时（t 1/2 of 1 h）高于 pH 6.0 时（t 1/212.4 小时）。这些研究的局限性在于，在 100°C 下，所有研究的蛋白质都处于展开状态。最近对在 100°C 以上的温度下具有最佳活性和稳定性的含二硫键的蛋白质的表征表明，二硫键可以成为 100°C 以上的稳定策略，并且构象环境和溶剂可及性是二硫键保护的决定性因素反对破坏。当在大肠杆菌中表达时，S. solfataricus 5'-甲硫腺苷磷酸化酶会形成不正确的、不稳定的二硫键。这一观察结果间接表明天然酶中存在的二硫键具有稳定性 ( 52 )。Aquifex pyrophilus最近描述的丝氨酸蛋白酶含有八个半胱氨酸（枯草杆菌蛋白酶 BPN' 中不存在） ( 64 )。二硫苏糖醇处理将其在 85°C 下的t 1/2从 90 小时减少到不到 2 小时。二硫苏糖醇在高温下的这种不稳定表明这种酶确实含有二硫键，而且它们很难接近。该酶在 105°C 和 pH 9.0 下的 6 小时t 1/2远长于在 pH 8.0 下计算的未折叠蛋白质中二硫键的t 1/2 (1 小时)，表明该酶的二硫键受到保护由于它们在蛋白质中的不可接近性而遭到破坏。因此，并非所有二硫键都对热破坏具有相同的敏感性。

疏水作用

如表中所建议的表44个并在表中说明的表 5,5个，疏水相互作用是超嗜热蛋白的稳定机制。对于隐藏在蛋白质折叠中的每个额外甲基，稳定性平均增加 1.3 (± 0.5) kcal/mol ( 269 )（基于空腔产生突变，其中较大的脂肪族残基被较小的脂肪族残基取代）。试图填充空腔的突变在产生需要局部重排的不利范德瓦尔斯相互作用时通常不太稳定 ( 158 )。而表的表55个给出了疏水相互作用在热稳定性中的潜在作用的晶体学证据，没有太多直接的实验证据可以证实疏水相互作用在超嗜热蛋白中的稳定作用。在伏打甲烷球菌和詹氏支原体腺苷酸激酶之间构建的酶嵌合体的稳定性特性表明，更大和更疏水的酶核心（这是由于脂肪族残基含量和脂肪族侧链体积的增加）可能是 M 的原因. jannaschii腺苷酸激酶的热稳定性 ( 124 )。来自嗜热栖热菌Thermus thermophilus的 3-异丙基苹果酸脱氢酶包含大肠杆菌酶中不存在的亚基间疏水相互作用。栖热菌属3-异丙基苹果酸脱氢酶 Leu246Glu/Val249Met 和大肠杆菌Glu256Leu/Met259Val 突变体衍生物的构建分别使栖热菌属和大肠杆菌酶不稳定和稳定。突变体和野生型酶在尿素存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳显示疏水相互作用使二聚体更耐解离 ( 180 )。

芳香相互作用

芳香-芳香相互作用（芳香对）由苯环质心之间小于 7.0 Å 的距离定义。通过对 34 个嗜温蛋白高分辨率结构中的 272 个芳香对的分析，提取了以下芳香对的特征：在三分之二的对中，相互作用的环接近垂直；大多数都参与网络；大多数连接不同的二级结构元素（即非局部相互作用）；大多数在能量上是有利的（80% 的势能在 0 到 −2 kcal/mol 之间）；大多数发生在掩埋或部分掩埋的残留物之间 ( 50 )。在结构已被解析的超嗜热蛋白中（表的(表5),5个), 至少有一个可以通过额外的芳香相互作用来稳定。P. furiosus α-淀粉酶还含有比地衣芽孢杆菌同系物多 5% 的芳香族残基，但尚不清楚这些额外的残基是否参与稳定相互作用 ( 85 )。嗜热蛋白中也存在一些例子。Thermitase 是Thermoactinomyces vulgaris产生的丝氨酸蛋白酶，含有 16 个参与芳香对的芳香残基；嗜温同系物解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶 BPN' 仅包含 6 个芳香对 ( 331 )。Thermus中也存在两类芳香相互作用大肠杆菌酶 ( 159 )中不存在的 RNase H。解淀粉芽孢杆菌RNase中暴露于溶剂的芳香族对 Tyr13-Tyr17被 Ala 或 Phe 残基取代（单突变和双突变）。Tyr-Tyr 和 Phe-Phe 对都对热力学稳定贡献了大约 -1.3 kcal/mol ( 303 )。

另一种涉及芳香族残基的相互作用存在于蛋白质中，但尚未就热稳定性进行研究。在阳离子-π 相互作用中，正电荷（最常见的是金属阳离子，但也可能是 Arg 和 Lys 的阳离子侧链）通常与芳香环的中心相互作用（示例如图 1 所示）。的图 4)。4个). 阳离子-π 相互作用的稳定能量不会随着 1/ r 3的变化而降低，而是表现出 1/ r n依赖性（ n < 2），这更类似于库仑相互作用 (1/ r ) 而不是疏水相互作用. 阳离子-π 相互作用对距离的低依赖性——以及 Phe、Tyr 和 Trp 不具有高去溶剂化能量并且很容易适应疏水环境的事实——使这些相互作用成为潜在的稳定机制 (88 )。

氢键

H 键通常由 H 供体和 H 受体之间小于 3 Å 的距离以及低于 90° 的供体-氢-受体角定义。氢键对 RNase T1 稳定性的影响已被仔细研究 ( 307 )。RNase T1 包含 86 个 H 键，平均长度为 2.95 Å。发现它们对 RNase T1 稳定性的贡献（约 110 kcal/mol，由诱变和展开实验确定）与疏水相互作用的贡献相当；单个 H 键平均贡献了 1.3 kcal/mol 的稳定性（307). 由于 H 键的识别高度依赖于距离截止值，并且由于许多超嗜热蛋白质结构尚未细化到足够高的分辨率，因此通过结构分析研究 H 键在热稳定性中的作用并未提供明确的答案。

Tanner 等人完成的一项研究。表明 GAPDH 热稳定性与带电中性 H 键数量之间存在很强的相关性（即带电残基的侧链原子与任何残基的主链原子或中性残基的侧链原子之间）（330). 坦纳等人。列出为什么这种类型的 H 键可能特别热力学稳定的两个原因：(i) 与掩埋此类 H 键相关的去溶剂化损失小于掩埋离子对（涉及两个带电残基）的去溶剂化损失，以及 (ii)由于电荷-偶极相互作用，带电中性 H 键的焓值大于中性-中性 H 键的焓值。带电中性 H 键与 GAPDH 稳定性之间的这种相关性表明带电残基在蛋白质稳定中的作用可能不仅限于形成离子对。在T. maritima铁氧还蛋白中也发现了数量增加的带电中性 H 键（表的（表 5）。5个). 这些氢键要么稳定转角结构，要么相互锚定转角。

离子对

因为离子对通常在蛋白质中以少量存在，而且它们不是高度保守的，所以它们不是蛋白质折叠的驱动力 ( 83 )。然而， Perutz ( 272 ) 的早期工作表明，静电相互作用代表折叠蛋白质中的重要稳定力。他指出，蛋白质中的离子对比溶剂中的离子对更强，因为它们是在固定电荷之间形成的。（在大量水中，溶剂化使相反电荷的稳定性几乎与距离无关。）计算出单个离子对负责 T4 溶菌酶 3 至 5 kcal/mol 的稳定性 (7 )。去溶剂化贡献[ ΔΔG（去溶剂化）] 与将带相反电荷的侧链聚集在一起相关的折叠自由能很大且不利。有人提出离子对在蛋白质中不稳定，因为这种 ΔΔ G（去溶剂化）没有被离子对提供的静电能充分补偿。这种不利的 ΔΔ G然而，（去溶剂化）在高温下会降低，部分原因是水的介电常数降低。这种还原几乎完全是静电的，主要影响表面带电的残留物（水分子的有序度较低，平均而言，在高温下离带电残留物更远）。因此，带电残基倾向于重新排列它们的构象以改善它们之间的直接静电相互作用，并且溶剂化自由能的损失几乎完全被与蛋白质中其他带电残基的相互作用能的增加所补偿（80、94). 虽然离子配对可能不是最佳的稳定机制——甚至可能会破坏嗜温蛋白的稳定性——但它可以代表超嗜热蛋白的强稳定机制，如表中所示的表 5。5个. P. furiosus GDH 与共生梭菌酶有 34% 的同一性。这两种酶结构的主要区别在于它们的离子对含量（表的（表 6）。6个). 更高百分比的带电残基参与离子对，特别是 Arg（P. furiosus GDH 中所有 Arg 残基的 90% 形成离子对）。P. furiosus酶每个残基包含 0.11 个离子对，而C. symbiosum GDH 中为 0.06 个（嗜温酶的平均值约为 0.04）。Arg 残基与羧酸形成离子对和 H 键。离子对形成纵横交错的蛋白质表面和亚基界面的大型网络。P. furiosus GDH 最大的离子对网络（图 1）。的(图5)5个) 由 24 个残基（属于四个不同的亚基）组成，由 18 个离子对连接。离子对网络在能量上比同等数量的孤立离子对更有利，因为对于每一对新离子对，掩埋成本减少了一半：只有一个额外的残留物必须去溶剂化和固定（368 ）。

太多了，没翻译完，剩下的之后再翻译。

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