qPCR那些曲线都代表什么?
在qPCR中会与各式各样的曲线打交道,每种曲线都有其不同的意义,甚至能够通过看曲线来发现实验中的一些问题。
我们知道PCR的本质其实就是一变二、二变四、四变十六······产物呈指数增长的数字游戏。
PCR原理
因此,在引物、模板、缓冲液、酶等都充足的理想状态下,荧光定量PCR的扩增曲线应该是这样的:
理想状态下的扩增曲线
然而,理想很疯狂,现实却很“性感”,看下面的“S型”曲线就知道,相对于理想状态下的扩增曲线,在dNTP和酶都有限的情况下,扩增曲线如下图所示,有一个平台期,酶逐渐失活,dNTP消耗殆尽,产物增加量逐渐减少;直至没有任何产物生成,数目保持恒定。
实际情况的扩增曲线
熔解曲线(Dissociation curve),就是随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。扩增反应完成后,通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线。
熔解温度上有一特征峰(Tm,DNA双链解链50%的温度),用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开,因为它们在不同的温度熔解度不一样。用荧光信号改变的负的一次导数(dR/dT)与温度作图,得出熔解曲线。
dR/dT 越大,表明荧光值变化最快。随着温度上升,达到Tm点时,大部分产物双链DNA解开,荧光值下降非常快。如果qPCR产物非常特异,熔解曲线在80-90之间会形成一个单峰(温度和qPCR产物长度以及GC含量相关)。
正常情况下,荧光定量PCR的产物是特异的,这时的熔解曲线应该是这样的:
正常情况下的熔解曲线
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