点击上方关注我们获取更多

背景

三代组装常用的软件有canu、Falon、WGTBG及SmartDenovo等。canu软件的优点是组装的准确度高、连续度表现优秀的概率高，缺点是速度比较慢；而WTDBG软件运行速度快、但是对重复序列比较敏感，对简单基因组组装效果较好，Falon比较合适一定的杂合基因组组装。而最近发布出来的hifiasm，可以在一周内完成超大基因组的组装，极大的降低了整体的分析时间。

加州红杉的相关数据如下：

服务器配置：64核 512Gb RAM

生成HiFi数据：46,000 CUP hours

基因组组装：7,200 CUP hours， 总共分析时间6天

为了进一步的了解这个软件的使用，我们下载了相关ccs的数据进行组装的测试。

01

软件原理

Hifiasm使用的是Pacbio的Hifi序列，基于单倍性的快速组装工具。不同于目前大多数软件，hifiasm在组装中尽可能的保留了多的单体型信息。

对于非trio家系的组装，输入的是hifi的序列(fastq或者fasta格式)，而对于trio家系的组装，除了需要hifi序列外，还需要父亲、母亲的index文件(可以使用yak来生成)。

02

软件安装

1# Install hifiasm (requiring g++ and zlib)2git clone https://github.com/chhylp123/hifiasm3cd hifiasm && make4# Assembly5./hifiasm -o NA12878.asm -t 32 NA12878.fq.gz

03

测试数据下载

从GIAB上下载pacbio的数据。GIAB是一个标准品的数据，里面包含了各种测序平台的数据，正好可以拿来作为测试数据。

路径为： ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/ReferenceSamples/giab/data/NA12878/PacBio_SequelII_CCS_11kb/

由于下载下来的是bam格式，需要转换成fasta格式。

samtools view *.bam | awk '{print ">"$1"\n"$10}' > fasta

04

软件参数说明

 1 ./hifiasm  2Usage: hifiasm [options]   <...> 3Options: 4    -o FILE       prefix of output files [hifiasm.asm] 5    -t INT        number of threads [1] 6    -r INT        round of correction [2] 7    -a INT        round of assembly cleaning [4] 8    -k INT        k-mer length [40] (must be  9    -i            ignore saved overlaps in *.ovlp* files10    -z INT        length of adapters that should be removed [0]11    -m INT        size of popped large bubbles for contig graph [10000000]12    -p INT        size of popped small bubbles for haplotype-resolved unitig graph [100000]13    -n INT        small removed unitig threshold [3]14    -x FLOAT      max overlap drop ratio [0.8]15    -y FLOAT      min overlap drop ratio [0.2]16    -v            show version number17    -h            show help information18Example: ./hifiasm -o NA12878.asm -t 32 NA12878.fq.gz19See `man ./hifiasm.1' for detailed description of these command-line options.

其中常用的为：

-o ：输出文件的前缀

-t：线程数

-k：kmer数

-z ：adapter的长度

05

软件使用

hifiasm -t 32 -o hifi fasta

-t 线程数目

-o 结果前缀

06

结果说明

prefix.r_utg.gfa (Haplotype-resolved raw unitig^【2】 graph in GFA^【3】 format)：该结果文件保留组装生成的所有单倍型信息包括体细胞突变，测序错误。

prefix.p_utg.gfa (Haplotype-resolved processed unitig graph without small bubbles )：对上面raw unitig 进行过滤，去掉由于体细胞突变和数据背景噪音引起的small bubbles(这个并不是真正的单体型信息)，对于高度杂合基因组物种优先选择这个结果。

prefix.p_ctg.gfa (Primary assembly contig^【4】 graph)：this is the preferred output for inbred strains or human，对于低杂合度物种来说，优先选择该文件；对于高杂合度物种，该结果代表其中一个单倍型。

prefix.a_ctg.gfa (Alternate assembly contig graph)：组装出来的另一套单体型基因组结果。

prefix.ec.fa ：Haplotype-aware error corrected reads in fasta format

prefix.ovlp.paf ：All-to-all overlaps in the PAF^【5】 format

07

结果测评

• 将hifiasm 组装 gfa 结果 转成 fasta

perl hifi2fa.pl ctg/utg.gfa outfile

• hifiasm 组装结果 fa N50评估

组装结果大小3.2G，和已知人基因组结果一致 N50：19M。

注意事项

• 投递内存设置 ：数据量100G 时建议投递1.5倍大小 100 *1.5= 150G内存。如果遇到内存报错，可按照3倍数据量大小内存设置进行投递。

• hifiasm 组装：通过比较发现，减小bubbles 的大小，会明显提升组装的速度，组装结果N50会降低。从准确度考虑，建议使用默认参数，增加线程数目。

END

reference

• https://github.com/chhylp123/hifiasm

• unitig(http://wgs-assembler.sourceforge.net/wiki/index.php/Celera_Assembler_Terminology)

• GFA(https://github.com/pmelsted/GFA-spec/blob/master/GFA-spec.md)

• contig(http://wgs-assembler.sourceforge.net/wiki/index.php/Celera_Assembler_Terminology)

• PAF(https://github.com/lh3/miniasm/blob/master/PAF.md)

作者：童蒙

编辑：amethyst

◆ ARGO-工作流部署与管理工具◆ 全长转录本的鉴定◆ DNA-RNA互作检测技术◆ORF的前世今生◆植物泛基因组的染色体重排的量化研究