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安装tar -jxf samtools-1.9.tar.bz2cd samtools-1.9/makeecho 'export PATH=/home/li.han/Softwares/samtools-1.9:$PATH' >> ~/.bashrc

用法

faidx

功能：提取fasta的长度信息

用法：samtools asidx [[...]]#生成一个名为ref.fa.fai的长度信息文件samtools faidx ref.fa

view

功能：将sam文件转换成bam文件；

对bam文件进行各种操作，比如数据的排序(不属于本命令的功能)和提取(这些操作是对bam文件进行的，因而当输入为sam文件的时候，不能进行该操作)；

将排序或提取得到的数据输出为bam或sam(默认的)格式。

bam文件优点：bam文件为二进制文件，占用的磁盘空间比sam文本文件小；利用bam二进制文件的运算速度快。

用法：samtools view [options] || [region ...]

参数：

-b输出BAM格式的文件

-f int获得mapped过滤设置，0为未设置

-F int获得unmapped过滤设置，0为未设置。

数字4代表该序列没有比对到参考序列上

数字8代表该序列的mate序列没有比对到参考序列上

-h默认输出的 sam 格式文件不带 header，该参数设定输出sam文件时带 header 信息

-H只打印header部分(no alignments)

-o FILE设置输出文件名

-q int最小的比对质量值 [0]

-S若是输入是 SAM 文件(默认输入是 BAM 文件)，则最好加该参数，否则有时候会报错。

-t FILE使用一个list文件来作为header的输入，一个制表分隔符的文件，对ref.fa使用命令“samtools faidx ”后，获得索引文件ref.fa.fai，使用此索引文件即可

-T FILE使用序列fasta文件作为header的输入

-u FILE输出非压缩的BAM，该参数的使用需要有-b参数，能节约时间，但是需要更多磁盘空间。

-@ INT设置线程数

示例：#bam转samsamtools view -h in.bam > out.sam#sam转bamsamtools view -bS in.sam -t ref.fa.fai > out.bam#输出没有比对上的read:samtools view -f 0x4 in.bam > out.sam#提取比对到参考序列上的比对结果samtools view -bF 4 abc.bam > abc.F.bam#提取paired reads中两条reads都比对到参考序列上的比对结果，只需要把两个4+8的值12作为过滤参数即可samtools view -bF 12 abc.bam > abc.F12.bam#提取没有比对到参考序列上的比对结果samtools view -bf 4 abc.bam > abc.f.bam#提取bam文件中比对到caffold1上的比对结果，并保存到sam文件格式samtools view abc.bam scaffold1 > scaffold1.sam#提取scaffold1上能比对到30k到100k区域的比对结果samtools view abc.bam scaffold1:30000-100000 > scaffold1_30k-100k.sam#根据fasta文件，将 header 加入到 sam 或 bam 文件中samtools view -T genome.fasta -h scaffold1.sam > scaffold1.h.sam

sort

功能：对bam文件进行排序，不能对sam文件进行排序，默认按染色体名称和位置大小顺序

用法：samtools sort [options]

参数：

-l INT小写L，设置输出文件压缩等级。0-9，0是不压缩，9是压缩等级最高。不设置此参数时，使用默认压缩等级

-m INT设置每个线程运行时的内存大小，可以使用K、M和G表示内存大小

-n按read名称排序

-o FILE将结果输出到指定文件而不是标准输出

-O FORMAT设置最终输出的文件格式，可以是bam，sam或者cram，默认为bam

-T PREFIX设置临时文件的前缀

-@ INT设置排序和压缩是的线程数量，默认是单线程

示例：#输出为out.bamsamtools sort -l 9 -m 90M -T sorted -@ 2 in.bam out    #老用法或samtools sort -l 9 -m 90M -T sorted -@ 2 -o out.bam in.bam

index

功能：对已经sort的bam文件进行建库，生成.bai文件

必须对bam文件进行默认情况下的排序后，才能进行index。否则会报错。建立索引后将产生后缀为.bai的文件，用于快速的随机处理。很多情况下需要有bai文件的存在，特别是显示序列比对情况下。

用法：samtools index [out.index]

参数：

-b创建bai索引文件，未指定输出格式时，此参数为默认参数

-c创建csi索引文件，默认情况下，索引的最小间隔值为2^14，与bai格式一致

-m INT创建csi索引文件，最小间隔值2^INT

-@ INT设置线程数

示例：#输出文件为in.bam.baisamtools index in.bam

tview

功能：将已经sort的bam文件比对结果形象化和可视化，使用不同的颜色区分比对质量和碱基质量

用法：samtools tview [ref.fasta]

示例：samtools tview in.bam ref.fa

说明：运行上述命令，进入可视化界面后，按“？”查看帮助信息；按“g”，输入：chr:position即可去到相应的位置

flagstat

功能：对bam文件统计比对情况

用法：samtools flagstat

示例：samtools flagstat in.bam

merge

功能：合并多个不同的bam文件

用法：samtools merge [-nr] [-h inh.sam] [...]

参数：

-f强制覆盖已经存在的bam

-h file把file作为输出bam的header

-l小写L，压缩等级1

-n合并后的bam按read名称排序

-r加上RG标签(inferred from file names)

-R str在特殊区域str内合并

-u输出非压缩的bam

示例：samtools merge -h in.header out.bam in1.bam in2.bam ...

请问对于同一份BAM文件使用samtools depth和用samtools mpileup跑出来的位点的depth有何差异？

你会注意到这个差异，应该是由于你所用的是Pair-End(PE)测序的数据吧，如果是SE数据，差异其实很小。对于PE测序数据主要有两个地方的差异：

(1)第一个差异，对于PE数据，mpileup默认会把不正常比对的PE Read(比如read1和read2的比对位置彼此间的距离超过插入片段长度的波动范围或者read1与read2有一条没有比对上)先排除掉再做计算，但samtools depth则不会，depth默认不做任何过滤，只要比上就算。这也是我们会看到samtools depth计算的覆盖深度往往都高于mpileup的最主要原因。如果要让两者一致，可以在mpileup中加上 -A 参数，强制留下不正常的PE比对结果即可；

(2)它们之间的第二个差异是，在默认情况下，mpileup还会过滤掉测序质量值低于13的碱基，depth默认不过滤。

虽然调整一下参数就可以保证两者一样。但我并不建议这么做，虽说mpileup这里得到的是高质量的覆盖深度，但是说到底它和samtools depth的目的还是不同的。

此外，如果要更好地计算比对数据的覆盖深度和覆盖度的话，samtools depth虽然能够胜任，但是功能还是比较单一，而且由于每个位点都会输出，导致结果文件总是很巨大，我还是比较推荐使用bedtools2来完成，如下图，它的功能和输出形式要更加丰富。

bedtools2计算基因组覆盖度的不同模式