正负筛选(neo正向+HSV-tk负向)原理
正负筛选的发展(用途)
正负选择系统是基因打靶的常用筛选方法之一。为了更好地筛选发生同源重组的克隆,1988年Mansour等人设计了正负双向选择系统(positive-negative-selection PNS), 解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。
正负筛选原理
同源重组时,只有载体的同源区以内部分发生重组,同源区以外部分将被切除。随机整合时,是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一,正选择基因多为neo基因,位于同源区内****,其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外,位于载体的3’末端,常用HSV-tk基因。
在同源重组时,tk基因将被切除而丢失,相反在随机整合时,所有的序列均保留(包括tk)。胸苷激酶蛋白(TK)可使无毒的丙氧鸟苷(GANC,也称为鸟嘌呤)转变为毒性核苷酸,而杀死细胞,因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时,G418和 GANC都有抗性。
随机整合时对G418有抗性,但对GANC敏感,细胞将被杀死
无整合的时候将被G418杀死。
用G418作正筛选,选出含有neo基因的细胞株,再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株,保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因
Neo具有双重作用,一方面导致靶基因的插入突变;同时作为重组细胞的正向筛选标志,该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。除了上述方法外,还可用PCR及Southern杂交法进一步筛选及鉴定中靶细胞
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