流式凋亡率计算_流式细胞术检测细胞凋亡问题
上海优宁维生物科技有限公司
1
、
Q
：
Annexin V R-PE 20 tests
是
BD
公司用于凋亡流式检
测的试剂盒，
产品显示种属为人，
请问能否用于大鼠细胞的
检测？
A
：可以。因为
Annexin V
是与
PS
亲和，而
PS
在不同种属
间应该没差异。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(
PS
)只分布
在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(
PS
)由脂膜内
侧翻向外侧。
Annexin V
是一种分子量为
35~36kD
的
Ca2+
依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰
丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此
Annexin V
被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将
Annexin V
进行荧光素
(
FITC
)
标记，
以标记了的
Annexin V
作为荧光探针，
利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡
的发生。
2
、
Q
：
用流式作细胞凋亡为什么跟
tunel
差别那么大啊？？
tunel
测出来的细胞凋亡率大概有
30%
而作流式测出来的凋亡率只有
2%
(阴性对照
0.5%
)差别好大啊，用的是
beckman
公司
的
Annexin V /PI
双染试剂盒，实验步骤如下：
(
1
)胰酶消化贴壁细胞，加培养基中止，离心
1000
转
5min
(
2
)吸去上清，
PBS0.5ml
重悬细胞(因为要送到别处作流式，期间路程约
1h
，户外温度
约
37
度)
(
3
)然后加入
Annexin V /PI
各
5
微升，避光
20min
，上机。
请问这是什么原因导致的？
A
：我也用这两种方法做过凋亡，是存在两种方法测的凋亡率差别有点大，但还没有大到你
这样的程度。双染测的是凋亡的早期事件
PS
外翻。
TUNEL
测的是凋亡最晚期的事件
DNA
片段化。而且
TUNEL
在检测过程中，把操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞，而且如
果
TUNEL
是肉眼计数的话，也会有判断上的误差，所以，往往
TUNEL
作出来的凋亡率高
一点。但如果凋亡率达到
30%
，
ladder
估计也应该跑的出来。双染虽然是机器操作，但在调
试补偿时，
人为的影响还是挺明显的，也不是特别的客观。基线稍微左移，
你的凋亡率就成
倍上升。
所以，
给你的建议是在经费、
时间允许的范围内再多做几次吧。
感觉这么大的差异，
可能这两种方法都会存在问题。还有，去流式的路上，装细胞的
ep
管最好插在冰上，拿着
冰盒。
3
、
Q
：可以用液氮保存瘤组织块，然后再做流式细胞分析吗？
A
：
我认为是不能的。
因为流式细胞分析要求细胞分散、
单个，
活性好，
这样才能区分死亡、
凋亡和活性细胞。
组织在冻存、
复温的过程中会有大量的细胞死亡，
同时经过这一过程的组
织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片，
不宜上流式检测了，
所以用于流式检测的
标本最好是新鲜标本，即取材后立即检测，效果最好。
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