Fret荧光共振能量转移

对于分子生物学来讲，生物分析手段的发展，是阐明机理的必要条件。

在研究分子间相互作用的道路上，人们不断探索，总结出很多方法，免疫技术，晶体衍射，核磁共振等。1948年，荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）理论被首次提出，它可以测定1.0-6.0nm距离内分子间的相互作用。1967年，这一理论得到了实验验证，将1.0-6.0nm的距离称为光学尺。二十世纪八十年代出，通过科学家的不断探索，Fret技术成功运用到蛋白质结构的研究中。自Fret荧光共振能量技术诞生以来，已结合多种先进的技术和方法，如电子显微镜，X射线衍射等，推动了分子生物学检测手段的发展。

作用原理

荧光共振能量转移技术，是采用物理方法去检测分子间的相互作用的方法。他适用于在细胞正常的生理条件下，验证已知分子间是否存在相互作用。此方法的检测原理如下；

将我们要检测的蛋白（如图X和Y），分别偶联上D和A荧光蛋白，D和A是一对荧光物质，我们称之为供体（donor）和受体（acceptor）。当用430nm的紫光去激发X融合蛋白时，它能够产生490nm的蓝色荧光；同样，当我们用490nm的蓝光去激发Y融合蛋白时，它能够产生530nm的黄色荧光。（结合图1）。

当蛋白X和Y间没有相互作用时（两者的空间距离>10nm），融合蛋白X和Y分别产生相应的荧光而被检测到，

如果蛋白X和Y间存在相互作用（两者的空间距离需<10nm，结合图2），用紫光激发融合蛋白X其产生的蓝光会被融合蛋白Y吸收，从而产生黄色荧光，这时，在细胞内将检测不到蓝色荧光的存在。这时因为能量从X融合蛋白转移到了Y融合蛋白，这就是荧光共振能量转移技术。

技术难点

一个理想的Fret相互作用体系，要求要有一对合适的荧光物质，即供体的发射光谱与受体的吸收光谱有明显的重叠。且当供体的激发波长时对受体无影响，供体和受体的发射光谱要完全分开，否则容易造成光谱干涉，而使反应体系不稳定。目前，较为常用的供体-受体分子对，主要有绿色荧光蛋白类（GFPs）和染料类。绿色荧光蛋白类有CFP-YFP，BFP-GFP，BFP-YFP等，染料类的有Cy3-Cy5，FITC-Rhodamine等。且这些荧光物质要能够标记在研究对象上。

应用要求

供体荧光基团和受体荧光基团的空间距离要<10nm；
供体的发射光谱与受体的接收光谱有相当的重叠；
供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面要求较高。

优缺点

优点	缺点
在活细胞的正常生理条件下进行检测，观察大分子在细胞内的构象变化与相互作用，并弥补了需破碎细胞检测相互作用的缺点；灵敏度高，可实现对单细胞水平的研究，研究单个受体分子；可与多种仪器和技术结合使用，如显微镜，色谱技术，电泳，流失细胞技术等；	应用比较局限，一般需要在待检测分子上偶联荧光物质（加上标记）；对实验要求较高，如供受体的光谱重叠不好，会导致荧光干扰，对供受体的抗干扰能力，水溶性等要求高；需要不断探索合适的供体和受体，且能够标记分子；难以观察瞬时的分子间作用，检测要求大量的样品；

应用

细胞内分子间的相互作用
膜蛋白的研究
细胞膜受体蛋白间的相互作用
细胞凋亡的研究
核酸检测

实验流程简述

以荧光物质CFP（供体）-YFP（受体）为例，检测AB蛋白在细胞内的相互作用。

细胞培养：根据实验培养特定的细胞用于转染，观察检测分子在细胞内的相互作用；
细胞转染：构建质粒载体CFP-A和YFP-B，将检测的AB蛋白分别偶联上荧光蛋白CFP和YFP，并将两个质粒共转染到培养的细胞内；
检测 FRET：质粒载体CFP-A和YFP-B转染细胞 10h、12h、18h、24h、36h、48h、72h 后检测，是否发生Fret；
FRET图像采集：确定 FRET 配对的激发波长，蓝光被调谐分别用于探测最大和最小的供体和受体信号，最大供体信号和最小受体信号对应的波长用于收集双表达细胞的 FRET信号。调整激光变化，以便获取最大 CFP 信号和最小 YFP 信号的激发光波长，采集供体和受体图像，收集 FRET 信号。每个细胞 FRET 检测重复 3 次，每种转染至少完成 6 个细胞的 FRET 检测;
FRET 数据处理：去除 FRET 信号中 DSBT 和 ASBT 的光谱串色信号；受体通路的FRET 信号需要对供体受体光谱灵敏度的变化进行矫正、对自发荧光和光学噪声进行矫正；利用矫正系数对双标定细胞进行象素匹配矫正。

生化实验技术——Fret荧光共振能量转移相关推荐

黑洞猝灭剂BHQ-2 acid,1214891-99-2,BHQ-2 Carboxylic Acid用作各种荧光共振能量转移，这种探针主要用于分析。
英文名称:BHQ-2 acid CAS:1214891-99-2 外观:深紫色粉末分子式:C25H26N6O6 分子量:506.52 储存条件:-20°C,避光避湿结构式: 西安凯新生物科技产品简 ...
可见光能量范围_通过能量转移技术实现双功能金属有机框架中分子马达的可见光驱动旋转...
人造分子机器和马达的发展使得设计和构建能够精确控制纳米级结构运动的特定分子结构成为可能.在这些人工系统中,过度拥挤的烯烃分子马达由于其手性控制的光化学驱动的重复单向旋转运动而备受关注.虽然已经证明这些 ...
交叉驰豫的影响因素_能量转移与交叉弛豫
2009 年 2 月 Journa l of Hebe i Polytechn i c Un i versity ( Natural Science Editi on ) Feb . 2009 文章编 ...
生化实验技术——酵母双杂交
酵母双杂交系统_酵母双杂交技术原理应用_相互作用分析-德泰生物酵母双杂交系统由Fields和 Song等人根据真核转录调控的特点创建.利用酵母双杂交系统能够快速.直接分析已知蛋白之间的相互作用,并能寻 ...
生化实验技术——蓝白斑筛选
蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法. 蓝白斑筛选_百度百科https://baike.baidu.com/item/%E8%93%9D%E7%99%BD%E6%96%91%E7%AD% ...
齐岳提供AIE分子N-苄基-4-溴-1, 8-蔡酰亚胺，近红外发射的BODIPY-PhOSi和BODIPY-DMA，超分子聚合物PNA-GBP·I2的合成
齐岳提供AIE分子N-苄基-4-溴-1, 8-蔡酰亚胺,近红外发射的BODIPY-PhOSi和BODIPY-DMA,超分子聚合物PNA-GBP·I2的合成 1,8-萘酰亚胺分子中也可以引入水溶性基团, ...
为什么程序猿996多猝屎，而企业家007却不会？
原作者公众号:Source Code Labs 查看全文 http://www.taodudu.cc/news/show-3053358.html 相关文章: [转]为什么程序猿996多猝屎,而企业家 ...
金属标记/荧光标记/功能化改性/官能团表面包覆聚苯乙烯微球
今日小编给大家分享的科研内容是金属标记/荧光标记/功能化改性/官能团表面包覆聚苯乙烯微球的相关研究,一起来看! 荧光聚苯乙烯微球制备: 采用分散共聚合法制备了单分散的负载有1,8-萘酰亚胺染料的荧光微 ...
第二章弛豫和共振信号的检测
第二章弛豫和共振信号的检测弛豫和弛豫时间弛豫的概念弛豫:在旋转磁场B1的作用下,低能态的核吸收能量向高能态跃迁:同时,由于自旋体系与周围环境相互作用,高能态的核向周围环境转移能量跃迁到低能态 ...

生化实验技术——Fret荧光共振能量转移