文献速递 | 新研究揭示一系列能够提高Cas9基因编辑和碱基编辑特异性的选择性核输出抑制剂
CRISPR基因编辑
CRISPR基因编辑是一项“年轻”的技术，但在疾病治疗中已经展示出广泛的应用潜力。在临床方案中，CRISPR-Cas9往往为组成型表达，容易导致Cas9核酸酶过度积累，最终增加其脱靶效应的机率。在更为精确的基因编辑工具中，如：碱基编辑（包括胞嘧啶碱基编辑CBE和腺嘌呤碱基编辑ABE）和先导编辑，类似问题依然存在。为此，研究人员试图探讨CRISPR抑制剂的应用对Cas9基因编辑和碱基编辑性能提升的可行性。
研究发现，一系列CRISPR抑制剂，如：抗CRISPR蛋白Acr，寡核苷酸和噬菌体多肽，能够通过可逆的、非共价的形式来干扰CRISPR-Cas9的作用过程。尽管CRISPR-Cas抑制剂种类繁多，这些抑制剂的作用机制以及治疗前景仍然尚未明确。
研究内容
近日，来自上海科技大学的刘佳团队揭示了一系列能够提高Cas9基因编辑和碱基编辑特异性的选择性核输出抑制剂（SINE）。有趣的是，SINE并不是直接靶向抑制Cas9，而是通过干扰Cas9 mRNA的核输出过程来调节Cas9的作用效果。在人源细胞中，该团队成功验证了这些SINE能够提高CRISPR-Cas9基因编辑、碱基编辑和先导编辑的精准度。该研究结果发表在国际期刊《Communications Biology》上，题目为KPT330 improves Cas9 precision genome- and base-editing by selectively regulating mRNA nuclear export。
筛选不可逆的CRISPR-Cas9小分子抑制剂
在携带“out-of-frame” EGFP报告基因的HEK293细胞中，作者加入各种候选化合物并通过细胞能否发出荧光来判别该化合物是否具有CRISPR-Cas9抑制性。一般情况下，CRISPR-Cas9靶向“out-of-frame” EGFP序列后能够使EGFP激活。一旦发现抑制剂，上述过程将会被阻断，EGFP表达受阻，细胞不会发出绿色荧光。首轮筛选发现了多个携带迈克尔受体的化合物对CRISPR-Cas9显示出抑制性。以此为基础，作者对含类似结构的已上市或处于研究阶段的化合物进行二轮筛选，发现一系列具有CRISPR-Cas9抑制性的KPT化合物（含FDA批准的抗癌药KPT330）。
SINE通过XPO1/HuR或XPO1/LRPPRC通路来调节Cas9 mRNA的核输出
定量分析结果显示，KPT化合物呈剂量依赖性地减少细胞质Cas9 mRNA对总Cas9 mRNA的占比，这意味着这些化合物主要调控Cas9 mRNA的胞内运输而不是转录过程。作者推测这些SINE的靶点为XPO1，一种负责调控核蛋白和RNA胞内运输的转运蛋白。
后续研究提示，KPT330与XPO1相互作用诱导蛋白酶体介导的蛋白质降解过程，在siRNA对XPO1的沉默作用的基础上进一步封锁XPO1对Cas9 mRNA的核输出。尽管KPT330需要通过XPO1下游的衔接蛋白HuR或LRPPRC来调节Cas9 mRNA的核输出，但不会直接作用于这些蛋白。
SINE提升Cas9介导基因编辑的特异性
通过CRISPR-Cas9靶向编辑与非靶向编辑之间的比率，可以看到各种SINE明显改善了CRISPR-Cas9编辑HBB和RUNX1基因位点的特异性。在HeLa和HEK293细胞中，KPT330和KPT8602均能显著改善CRISPR-Cas9编辑AAVS1、EMX1-2、HBB、FAT和EMX1-3这些基因位点的特异性。相比之下，Acr这种已知能够改善CRISPR-Cas9特异性的化合物无法适用于所有测试的细胞和/或基因位点。
SINE改善CBE编辑特定区域的性能
最后，作者还探讨了各种SINE对Cas9碱基编辑和先导编辑性能提升的可行性。尽管KPT185、KPT330、KPT335和KPT8602对BE3或A3A CBE的靶向和非靶向编辑过程均显示出抑制作用，这些SINE对CBE的非靶向编辑过程的抑制作用更为显著，有助于规避脱靶效应。同样地，在HEK293T细胞，这些SINE也能抑制多个基因位点的先导编辑过程。
总结
总之，该研究首次筛选出一系列CRISPR-Cas9间接、不可逆抑制剂。这些抑制剂（SINE）包含了FDA批准的抗癌药KPT330，主要通过干扰Cas9 mRNA的核输出过程来调节Cas9的作用效果，有望用于提高CRISPR-Cas9基因编辑、碱基编辑和先导编辑的精准度。
本研究中使用的Cas9 mRNA由APExBIO提供，APExBIO在体外转录领域深耕多年，可提供体外转录合成所需的修饰核苷酸、转录酶、加尾酶和一系列用于mRNA纯化、包被、分析和检测的产品。此外，公司还提供一系列现成的报告基因或工具基因mRNA，如EGFP mRNA, Cas9 mRNA等，您可以根据需求选择不同的共转录加帽类型（Cap 0或Cap 1）和修饰核苷酸种类的产品。详情可前往官网www.apexbio.cn查询
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