如何判断 qPCR 数据有效性

通常需要结合扩增曲线，溶解曲线，标准曲线来进行综合分析。

1. 扩增曲线应呈现出平滑的S型曲线，起始无扩增，起峰时间正常，能达到平台期。由扩增曲线得到的Ct值是判断实验成功与否的重要参考，Ct值有一定的可信范围，一般建议，阳性结果（科研）调整到15-30之间，阴性对照Ct>35，内参基因一般小于20，且样品间内参的Ct值差不超过 1，表明内参基因表达量稳定，复孔Ct值标准偏差不超过 0.5。
2. 溶解曲线应呈现单峰，峰的宽度较小，表明是特异性扩增。
3. 标准曲线的斜率范围 -3.58 ~ -3.10，对应引物的扩增效率 90%~110%，R² 代表线性拟合度，一般大于 0.98。
   

qPCR 常见问题及解决方案

1. 扩增曲线不稳定

• 可能原因：RNA 纯度低；体系中存在较多杂质；仪器使用时间过长。
• 解决方案：
  1. 提取高纯度的 RNA，小心操作；
  2. 对仪器进行校准。

2. 扩增无法达到平台期

• 可能原因：模板浓度太低；循环数太少；试剂扩增效率低。
• 解决方案：
  1. 提高模板量；
  2. 提高循环数；
  3. 用标准曲线测定扩增效率，提高镁离子浓度，换用扩增效率高的试剂。

3. 荧光下降

• 可能原因：存在降解；模板浓度过高。
• 解决方案：
  1. 提高体系纯度；
  2. 降低模板量；
  3. 降低荧光阈值。

4. 单峰，峰不尖锐

• 可能原因：与试剂成分有关；或存在大小相近的非特异性扩增。
• 解决方案：
  1. 温度跨度不高于 7 度，视为可用结果；
  2. 进行高浓度琼脂糖电泳，确认是否为单一条带。

5. 单峰，Tm 低于 80 度

• 可能原因：只有引物二聚体，无目的条带；或扩增片段过短。
• 解决方案：
  1. 检查是否加入模板；
  2. 进行琼脂糖电泳检测，确定条带大小是否正确。

6. 双峰，较低峰 Tm 在 80 度之前

• 可能原因：由于模板浓度过低或引物浓度过高使多余引物形成引物二聚体。
• 解决方案：
  1. 适当提高退火温度；
  2. 提高模板量，降低引物浓度；
  3. 重新设计引物。

7. 严重双峰，Tm 都在 80 度以后

• 可能原因：引物特异性过差或交叉污染。
• 解决方案：
  1. BLAST 检查引物特异性，重新设计引物；
  2. 在超净台中，换用移液器分别加入引物，避免交叉污染。

8. 其他非正常熔解曲线

• 可能原因：应体系污染、试剂失效；耗材与仪器不匹配，检测通道不正确；仪器长时间未做矫正。
• 解决方案：
  1. 在无模板洁净区内配制体系；
  2. 避免将试剂暴露在强光或高温下；
  3. 避免试剂过期；
  4. 做好阳性、阴性对照；
  5. 选用与仪器匹配的耗材；
  6. 定期请工程师进行仪器校准。

9. 标准曲线线性关系不佳

• 可能原因：加样误差；标准品降解；模板浓度高或有抑制物；引物或探针不佳；PCR 酶灵敏度不高及活力下降。
• 解决方案：
  1. 标准品加样体积大于 2ul、引物预混后再分复孔，定期校正移液器，尽量选择硅化枪头，使用文库稀释液稀释标准品，降低耗材管壁对 DNA 吸附；
  2. 避免反复冻融、电泳检测发现降解后重新制备稀释标准品；
  3. 改变稀释精度，增加稀释梯度；
  4. 重新设计引物和探针；
  5. 更换灵敏度更高，线性关系更好的试剂，校正-20℃冰箱，使用时将酶置于冰上。

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