Worthington过氧化物酶活性的6种测定方法
过氧化物酶 (HRP) 是一种血红蛋白,可催化过氧化氢氧化多种底物,例如抗坏血酸盐、亚铁氰化物、细胞色素 c 和许多染料的无色形式。HRP 的分子量为 40 kDa,最适 pH 值为 7.0。稳定性:HPOFF 在 2-8°C 下可稳定 9-12 个月。HPOD 在 2-8°C 下可稳定 2 至 3 年。
单位定义:一个 Worthington 单位在 25°C、pH 7.0 下使用氨基安替比林和苯酚每分钟分解 1µmole H 2 O 2 。
技术说明:RZ (Reinheitzahl) 是吸光度比率,A 403 /A 275,已被用作纯度的指示。然而,Shannon et al., JBC, 241 , 266 (1966) 报道了同工酶的这个比率在 2.50 到 4.19 之间变化。这一点,连同缓冲液和 pH 值的影响,似乎使这个比率作为纯度标准的准确性受到质疑。
许多不同的方法用于过氧化物酶活性的测定。下面列出了由艾美捷Worthington确定的一些近似转换。
• 1 个 Worthington 单位 = 4.6 个 Worthington 以前使用的邻联苯胺单位
• 1 个 Worthington 单位 = 0.62 个 ABTS 单位(每分钟氧化的微摩尔染料,pH 6.0,25°C,1.7 mM 染料)
• 1 个 Worthington 单位 = 2 个 ABST 单位( µmole 每分钟氧化的染料,pH 5.0,25°C,8.7 mM 染料)
• 1 Worthington 单位 = 0.5 愈创木酚单位(每分钟氧化愈创木酚的 µmole,pH 7.0,25°C)
• 1 Worthington 单位 = 0.5 连苯三酚到 purpogallin单位(mg 产品每 20 秒,pH 6.0,20°C)
• 1 Worthington 单位 = 5 连苯三酚到 purpogallin 单位(在 pH 6.0,30°C 下每分钟微摩尔产品)
艾美捷Worthington过氧化物酶的测定:
方法:传统上,过氧化物酶活性以连苯三酚的氧化速率为单位表示,这是 Willstalter 和 Stoll 在 1917 年引入的一种方法,最近的研究表明这种方法有些不足。(Maehly 和 Chance 1954。)在过氧化物酶测定系统中已经使用了多种氢供体,包括可能致癌的化合物,例如邻联茴香胺。采用 4-氨基安替比林作为氢供体的改进测定法已被采用(Trinder 1966)。反应速率通过测量过氧化氢分解引起的 510 nm 处吸光度的增加来确定。在指定条件下,在 25°C 和 pH 7.0 条件下,一个单位会导致每分钟分解 1 微摩尔过氧化氢。
试剂:
0.2 M 磷酸钾缓冲液 pH 7.0
0.0017 M 过氧化氢。用试剂级水将 1 ml 30% 过氧化氢(Merck Superoxol 或等效物)稀释至 100 ml。用 0.2 M 磷酸钾缓冲液 pH 7.0 将 1 ml 该溶液进一步稀释至 50 ml。每天准备新鲜。
0.0025 M 4-氨基安替比林和 0.17 M 苯酚:通过将 810 mg 苯酚溶解在 40 ml 试剂级水中进行制备。加入 25 mg 4-氨基安替比林并用试剂级水稀释至终体积为 50 ml。
酶:
以 1 mg/ml 溶解在试剂级水中。临用前,进一步稀释以获得 0.02-0.04 ΔA/min 的速率。
程序:
将分光光度计调整到 510 nm 和 25°C。
将移液器移入每个比色皿,如下所示:
苯酚/氨基安替比林溶液 1.4 毫升
0.0017 M过氧化氢 1.5 毫升
在分光光度计中于 25°C 孵育 3-4 分钟以达到温度平衡并确定空白率(如果有)。加入 0.1 ml 稀释酶并记录 A 510的增加4-5 分钟。从曲线的线性部分计算ΔA 510 /分钟。
计算:
注:虽然用苯酚安替比林法得到的反应速率比以前的方法低 4.5-4.7 倍,但过氧化物酶制剂是相同的。
RZ (Reinheitzahl) 是吸光度比,A 403 /A 275 (RZ) 已被用作纯度的指示。然而,香农等人。(1966) 报告说,同工酶的这个比率从 2.50 变化到 4.19。这一点,连同缓冲液和 pH 值的影响,似乎使这个比率作为纯度标准的准确性受到质疑。
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