利用基因沉默和过表达技术研究棉花的基因功能

题目：The GhMYB36 transcription factor confers resistance to biotic and abiotic stress by enhancing PR1 gene expression in plants

期刊名：Plant Biotechnology Journal

作者：Tingli Liu, Baolong Zhang

单位：江苏省农科院

赛思基因（www.scientsgene.com），专注遗传转化技术的应用于开发，致力于打破基因型限制，助力基因编辑育种。

摘要

干旱和黄萎病是限制棉花产量的两个重要因素，因此需要确定关键的分基因，以同时提高棉花对黄萎病的抗性和对干旱胁迫的耐受性。R2R3 型的MYB 蛋白可以发挥这种作用，因为它们在植物发育、生长和代谢调节中的始终具有这种功能，然而，迄今为止，尚未在棉花中发现赋予所需的生物和非生物胁迫抗性的MYB基因。

GhMYB36是一种在陆地棉中编码R2R3 型MYB蛋白的基因，它赋予拟南芥和棉花抗旱性和抗黄萎病菌的能力。GhMYB36沉默的棉花植物对干旱胁迫和黄萎病更敏感。GhMYB36在转基因拟南芥和棉花植物中的过表达提高了耐旱性和黄萎病抗性。烟草细胞中融合的GhMYB36-GFP 的瞬时表达能够将GhMYB36定位在细胞核中。此外，在过表达GhMYB36的转基因拟南芥中，RNA-seq分析和qRT-PCR验证显示PR1表达量显着增加。荧光素酶相互作用实验表明，GhMYB36 可能与PR1的启动子结合以激活其表达和相互作用，这进一步通过酵母一杂交测定得到证实。总之，我们的结果表明，GhMYB36作为转录因子发挥作用，通过增强PR1表达，参与拟南芥和棉花的耐旱性和黄萎病抗性。

技术路线

主要结果

3.1 GhMYB36是棉花耐旱性所必需的

为了研究GhMYB36在耐旱性中的作用，我们使用 VIGS 方法下调了GhMYB36的表达。用作阳性对照的 CLCrV-CHLI 载体处理的植物表现出预期的光漂白表型。通过qRT-PCR分析评估GhMYB36表达的下调。VIGS植物中GhMYB36的表达水平降低到WT的 32.7%，但在空载体 (EM) 植物中没有改变。为了检查其旁系同源物交叉沉默的可能性，选择最接近 GhMYB36 的 NP_001314379.1、XP_016690362.1 和 XP_016722658.1 进行表达评估。如 qRT-PCR 所揭示的，这三个基因的转录物积累在GhMYB36 VIGS 植物中没有受到影响，表明 VIGS 对GhMYB36的特异性下调。然后通过将GhMYB36 -VIGS 植物与 WT 植物一起浸入18% PEG 中 48 小时来模拟干旱情况，并评估它们对渗透胁迫的反应。如图2a所示，很明显 VIGS后，下调的GhMYB36能够增加植物对渗透胁迫的敏感性，因为GhMYB36-VIGS植物表现出比 WT和EM对照植物相对严重的萎蔫表型。为了量化萎蔫水平，测量了叶片 RWC，在 PEG 处理后，GhMYB36 VIGS 植物中的叶片 RWC 显着低于WT 和 EM 植物，但保持不变的正常条件（图2b）。

3.2 GhMYB36在拟南芥中的过表达提高了对干旱胁迫的耐受性

为了证实GhMYB36在植物干旱胁迫期间的体内功能，GhMYB36在拟南芥中异源表达。根据卡那霉素抗性筛选出16个T2转基因株系，并通过基因组PCR和RT-PCR验证。通过 PCR、RT-PCR 和蛋白质印迹确认的三个T3系（OE1、OE2 和 OE7）用于检查耐旱性。此外，我们确定了转基因种子在含有甘露醇模拟干旱胁迫的 MS 培养基上的发芽率。转基因种子和在正常培养基上培养的 Col-0 种子之间没有显着差异（图3a，b），这与过表达GhMYB36的转基因种子形成鲜明对比，与含有 450 mm或 500 mm甘露醇的培养基上的 Col-0 种子相比，其发芽率显着提高（图3a，b）。

在正常水分条件下，GhMYB36转基因拟南芥幼苗与CK的营养生长和生殖生长均无差异（图3C）。然而，在脱水30 天后，只有 25% 的CK植物存活，而大多数转基因幼苗表现出正常生长。经过 15 天的干旱处理后，转基因拟南芥中的 T-AOC 显着高于 WT 植物（图3e），这是GhMYB36赋予拟南芥耐旱性的表现。

3.3 GhMYB36在棉花中的过表达提高了对干旱胁迫的耐受性

相同的GhMYB36过表达载体也通过农杆菌介导的转化转化到陆地棉的基因组中。卡那霉素选择后产生了 16 株源自独立胚性愈伤组织的T0植物，所有这些植物在棉铃数、纤维产量和质量方面都显示出与 WT 植物相似的表型。通过 PCR、Southern 印迹和蛋白质印迹分析证实GhMYB36构建体整合到棉花基因组中。来自过表达转基因棉花系OX1和OX2的两周龄植物GhMYB36用于停水 14 天时的耐旱性分析。WT 系在早期变得严重褪绿，枯萎，许多无法生存。相比之下，OX1 和 OX2 表现出相当轻微的枯萎症状和比 WT 更少的死亡（图4a）。再浇水2天后，转基因植物OX1和OX2的成活率分别为65%和75%，明显高于WT（<20%）（图4b）。这些结果表明 GhMYB36 正向调节拟南芥和棉花的干旱胁迫反应。

3.4 GhMYB36可以提升拟南芥和棉花对黄萎病菌的抗病性

为了评估过表达GhMYB36的拟南芥抗病性，选择了三个转基因系 OE1、OE2 和OE7的3周龄幼苗和 WT对照植物，并接种黄萎病菌。由于 WT 植物表现出典型的V. dahliae感染症状，表现为发育迟缓、萎蔫、萎黄和坏死，但所有转基因植物都明显抵抗这种真菌病，只表现出轻微的症状（图5a）。表型显然与V. dahliae定植的程度相关，这通过疾病指数和 qPCR 得到证实（图5b，c）。在V. dahliae处理的两个过表达GhMYB植株（OX1和OX2）的转基因棉花品系中进行了类似的观察（图5d）。在整个植物发育过程中，OX1 和 OX2 的疾病指数均显着低于 WT，并且表型与V. dahliae定殖的程度相关，这已通过 qPCR 验证（图 5e ， f）。总之，这些实验令人信服地证明了 GhMYB36 在赋予拟南芥和棉花黄萎病菌抗性方面的潜在功能作用。

3.5 GhMYB36是细胞核定位蛋白，通过与 PR1 启动子结合来激活PR1基因的表达

为了确定GhMYB36的细胞定位，通过在本氏烟中使用农杆菌浸润进行 GhMYB36-GFP 融合蛋白的瞬时表达。如图7a所示，检测到代表 GhMYB36 定位的 GFP与细胞核中的 DNA 特异性荧光染料 DAPI 共定位。

在干旱处理或黄萎病菌攻击下对GhPR1进行VIGS下调以进一步检查 PR1 功能。在农杆菌介导的 VIGS 浸润三周后，qRT-PCR 分析显示GhPR1表达显着降低（图8b）。因此，GhPR1 VIGS棉花植物变得更容易感染V. ahlia (图8a ) 并在干旱胁迫下显示出比对照植物更严重的萎蔫表型。

总结

GhMYB36 作为转录因子发挥作用，可提高拟南芥和棉花的耐旱性和黄萎病抗性。虽然GhMYB36 响应干旱和V. dahliae的活性机制归因于PR1的激活表达，但是存在GhMYB36靶向其他基因以实现其潜在的多样化功能的可能性。该研究不仅阐明了GhMYB36响应生物和非生物胁迫的功能作用的分子机制，而且为分子育种和生物技术进步提供了有效的理论支撑。

原文链接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13751?af=R

赛思基因（www.scientsgene.com），专注遗传转化技术的应用于开发，致力于打破基因型限制，助力基因编辑育种。

利用基因沉默和过表达技术研究棉花的基因功能相关推荐

「文献解读」利用基因沉默和过表达技术研究棉花的基因功能
赛思基因(www.scientsgene.com),专注遗传转化技术的应用于开发,致力于打破基因型限制,助力基因编辑育种. 题目:The GhMYB36 transcription factor co ...
外挂辅助技术研究-完善选怪功能
1.分析选中怪物,NPC,玩家功能 1.取消之前选中对象 [[31CE73C]+14b8]==ID 2.选中当前对象 dd [031CE740+4*0] //对象列表玩家背包动作人物对象 [3 ...
外挂技术研究-封装动作数组功能
目标: 1.封装动作对象 2.封装动作对象列表 3.封装使用对象功能函数作业: BOOL TActionList::UseAction(char* szpActionName) //背包对象怪物对 ...
外挂辅助技术研究-分析选怪功能
目标: 1.分析选怪功能选怪变量=数据 //怪物对象ID //怪物对象地址 0049F902 - 89 45 F0 - mov [ebp-10],eax 0049F905 - 53 - push ...
广东生态所孙蔚旻团队EST发表利用稳定同位素示踪-宏基因组分箱联用技术揭示砷污染土壤中的厌氧砷氧化微生物及其代谢途径...
广东省生态环境技术研究所孙蔚旻团队ES&T发表:利用稳定同位素示踪-宏基因组分箱联用技术揭示砷污染土壤中的厌氧砷氧化微生物及其代谢途径第一作者:张苗苗通讯作者:孙蔚旻通讯单位:广东省生态 ...
es like and or_广东生态所孙蔚旻团队ESamp;T发表利用稳定同位素示踪宏基因组分箱联用技术揭示砷污染土壤中的厌氧砷氧化微生物及其代谢途径...
广东省生态环境技术研究所孙蔚旻团队ES&T发表:利用稳定同位素示踪-宏基因组分箱联用技术揭示砷污染土壤中的厌氧砷氧化微生物及其代谢途径第一作者:张苗苗通讯作者:孙蔚旻通讯单位:广东省生态 ...
甜瓜过表达技术——bHLH转录因子调控果实发育
文章信息 1 题目:Genome-Wide Identification and Characterization of Melon bHLH Transcription Factors in Reg ...
「文献解读」利用大豆过表达和基因编辑技术研究GmBICs基因的功能
赛思基因(www.scientsgene.com),专注遗传转化技术的应用于开发,致力于打破基因型限制,助力基因编辑育种. 文章信息 1 题目:GmBICs Modulate Low Blue Lig ...
百姓基因：新一代基因测序技术及其在肿瘤研究中的应用
基因测序技术的进步, 为分子生物学的发展, 起到了巨大的推动作用.传统的基因测序技术的重要代表, 是所谓的Sanger测序法, 这是一种以末端终止法为原理建立起来的技术.20世纪90年代开始启动的人类 ...

利用基因沉默和过表达技术研究棉花的基因功能

利用基因沉默和过表达技术研究棉花的基因功能相关推荐

最新文章

热门文章