导读

这篇文章仅仅纳入了8个检测对象，但是作者用这屈指可数的样本不仅分析了冷冻、乙醇、RNAlater三种保存方法对标本的微生物群组成、宏基因组和宏转录组的影响，还分析了口腔和肠道微生物在微生物群组成、宏基因组和和宏转录组上的关系，最后还详细的比较了肠道宏基因组与肠道宏转录组之间的差异。因此，虽然这篇文章早在2014年就已经由大佬Huttenhower发表在PNAS上了，但是我还是想拿出来讲一讲。篇幅有限，感兴趣的朋友一定要看原文哦。

一、介绍

1. 摘要：

尽管人体微生物群组成的研究取得了很好的进展，但是微生物群中的超过 800万的基因及其调控仍然没有被描述清楚。部分原因是难以获得大量的适合做微生物群功能研究的标本。因此我们设计了前瞻性队列研究：1)在多个体多部位采集标本；2)用多种方法保存；3)先人一步进行了人体宏基因组和宏转录组的联合分析。内容1：收集8名健康受试者的粪便标本和唾液标本，然后分别用三种不同的方法(冷冻、乙醇、RNAlater)保存粪便以比较收集方法对微生物群组成、宏基因组和宏转录组的影响。内容2：分析同一个体不同部位的宏测序数据，研究口腔和肠道微生物之间的关系。内容3：分析肠道宏测序数据，比较宏基因组与宏转录组。

2. 文章简介

Title：Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut

标题：人体肠道中的宏基因组与宏转录组

发表杂志：PNAS，美国科学院院报

影响因子：9.58

通讯：Curtis Huttenhower

单位：哈佛大学生物统计学系

时间：2014年

3. 通讯作者简介

Huttenhower教授工作于哈佛大学公共卫生学院，生物统计学系和免疫生物学与感染性疾病部门，以及Broad研究所。近些年，Huttenhower以通讯作者的身份在Nature Method、Nature Biotechnology、Genome Biology等杂志上发表过MetaPhlAn、MetaPhlAn2、PICRUSt、LEfSe、HUMAnN、HUMAnN2。其中PICRUSt被引量高达2820，LEfSe被引量也高达2712。Huttenhower实验室还开发了很多网页工具，其中包含LEfSe、PICRUSt等。因为是基于网页的，所以广大的Windows用户也能轻松的使用。对分析感兴趣老师和同学不要错过哦。

网页地址：http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/

言归正传，下面一起看这篇文章进行了怎样的研究：

二、研究设计

方法路线.png

收集8个参与者提供的口腔(唾液)和粪便标本。口腔标本的处理方法：1)冰冻法保存；2)宏基因组测序。粪便标本的处理方法：1)同一参与者的粪便标本分成三份分别用冰冻、酒精、RNAlater三种方法保存；2)每份标本同时进行宏基因组和宏转录组测序。生物信息学分析：1)使用MetaPhlAn进行物种注释；2)使用HUMANn进行基因和通路注释。

三、研究结果

1. 内容一：标本保存方法对微生物群组成、宏基因组和宏转录组的影响如何？

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结果说明：

Spearman相关分析发现不同方法保存的标本的群落组成(图A)、基因功能成分(图B)和转录功能成分(图C)高度一致。图ABC中的黑色线条表示每组8个相关系数的平均值。方差分析进一步分析标本处理效果发现：1)微生物群组成(图D)和宏基因(图E)没有显著的标本处理效果；2)< 5%的转录本表现出显著受标本处理方法的选择的影响(图F)。

2. 内容二：口腔和肠道微生物群落之间有何关系？

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结果说明：

分析8对粪便和口腔标本的宏测序数据(联合分析HMP数据)。采用Bray-Curtis距离算法聚类样本，和等级相关算法聚类微生物。图A表明：1)口腔和粪便的微生物组成差异很大；2)丰度较高的口腔微生物在肠道中的丰度却很低。图B表明：口腔中丰度最高的8种微生物的DNA在同一个体的粪便中含量也较低，转录活性也非常低。灰色线连接来自同一个体的口腔DNA (淡蓝色)、肠道DNA (深蓝色)和肠道RNA (红色)。也有不同的情况，如图C中的D. invisus虽然是一种肠道优势物种，但是也能在口腔大量存在。

3. 内容三：肠道宏基因组与宏转录组有何差异？

1)功能丰度差异：

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结果说明：

KEGG注释后一共获得3,292个相对丰度 > 0.01%的KOs。KOs(基因)和KOs(转录本)的平均相对丰度有很高的相关性 (Spearman’s r = 0.76)。图A至图H为8个不同的KOs分类：1)红点是RNA > DNA的KOs；2)蓝点是DNA > RNA的KOs；3)x或y轴上的点表示一个数据集中丰度为零，而另一个数据集中的丰度不为零的KOs。

2)微生物群组成、宏基因组和宏转录组在个体间的稳定性：

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结果说明：

丰富最高的10个属在个体间的变异最大(图A)，宏转录组中丰富最高的10个Gene Families次之(图B)，宏基因组中丰富最高的10个Gene Families最稳定(图C)。使用Pielou 指数和Bray-Curtis指数分别计算比较三组间均匀度(图D)和多样性(图E)也能得到相似的结果，即个体间的稳定性：宏基因组 > 宏转录组 > 微生物群落。

3)功能模块在宏基因组和宏转录组之间的稳定性：

内容3.3.png

结果说明：

图A、B、C显示了在个体间有显著差异的三个功能模块中分别包含的四个丰富最高的基因在个体间变化的情况。图A、B、C中的基因在RNA水平上的变异 > DNA水平上的变异。来自同一个体的RNA(红色)和DNA(蓝色)的测量值由灰线连接。但也有少数相反的案例，如蛋白酶体(图D)在RNA水平上的变异 < DNA水平上的变异。

文章看点

看点1：

冷冻、乙醇、RNAlater三种保存条件中的微生物群落、宏基因组和宏转录组高度一致。不同保存方法对标本内的生物学信息影响不大。

看点2：

口腔微生物能进入肠道并存活下来的数量很少、转录活性也很低。口腔和肠道的环境差异很大，人体微生物中能同时适应两种环境的数量很少。

看点3：

宏基因组 PK 宏转录组：1)宏基因组和宏转录组中的生物功能在有很高的一致性；2)个体间的稳定性：宏基因组 > 宏转录组 > 微生物群落；3)多数基因在RNA水平上的变异 > DNA水平上的变异。

总结：该研究不仅建立了宏基因组和宏转录组联合研究的标本收集方法和运输方法，还分析人体口腔微生物组与肠道微生物之间的关系，最后还阐述了肠道宏基因组与肠道宏转录组之间的关系。宏基因组包含的信息在微生物群中是较为稳定的，宏转录组的变化性虽然大，但是更能反应微生物群功能的实时变化，宏转录组有助于研究微生物群在人体、动物、植物、环境等中的功能机制。