BRAF蛋白F595S G615R突变的影响

目的：使用在线Webserver，分析突变对蛋白质表型、稳定性、结合亲和力的影响。

步骤：

查找突变数据：选择癌症相关基因BRAF，从COSMIC数据库下载BARF错义突变数据。
查找结构数据：进入PDB，搜索BRAF，下载BRAF蛋白质单体的结构pdb文件、以及BRAF与其他蛋白结合的复合物pdb文件。
突变数据分析：使用R语言，统计突变相关位点，筛选出突变位点。
使用SNPs3D、S3Ds GO、PolyPhen-2、PROVEAN、MutPred2、MutPred等Webserver，评估突变是否对蛋白质有损害或良性的影响。
使用foldx、IMutant、DUET、NeEMO、MAESTRO、MuPro等Webserver，评估突变对蛋白质稳定性的影响
使用MutaBind、BeAtMuSiC、ELASPIC评估突变对蛋白质结合亲和力的影响

整体流程图如下

一、COSMIC数据下载

进入COSMIC，搜索BRAF基因，查找突变信息，可以看出来，Mutation中99.11%为Missense substitution，选择Missense substitution，下载全部错义突变数据，共计50046条记录。

图表 1 突变类型分布
接下来，使用R语言，统计错义突变的分布，由饼状图可以发现，在93.8%的样本中，第600位缬氨酸(V)突变为谷氨酸(E)，这暗示着V600E在全部的Missense mutation中有着很强的统计学意义。除此之外，突变种类也很多，达到177种，有着许多频率较低的罕见突变，而这些罕见突变对于BRAF的影响尚且没有特别深入的研究，由于尚且不清楚哪儿些突变对蛋白质，以下报告将对全部177种突变进行分析。

图表 2错义突变类型分布

二、pdb数据库调研(前一次作业结果)

进入pdb数据库，搜索BRAF蛋白，选取一个“BRAF蛋白+其他蛋白复合物”和一个BRAF蛋白质单体。蛋白质复合物需要完整蛋白，不能是肽段，而且均需要来源于人类。经过一系列仔细审查，最终选择编号“4MNE的BRAF+MEK1蛋白质复合物”以及“4WO5的BRAF蛋白质单体”。

三、突变对表型影响

为了更加全面综合地进行数据分析，有必要采用多种分析手段，并对结果进行整合。因此，实验之初，就将177种突变全部依次上传各种服务器，计算突变对表型的影响，使用如下六个服务器：SNPs3D、S3Ds GO、PolyPhen-2、PROVEAN、MutPred2、MutPred，将这六个服务器计算出来的结果：“良性突变or有害突变”作为新的特征。由于S3Ds GO计算时候会舍弃部分突变，导致后续分析数据不全，最后舍弃S3Ds GO计算结果； MutPred2计算后结果没有明确说明是良性突变or有害突变，最后也舍弃MutPred2计算结果；而SNPs3D自身会使用“PhD-SNP”、“PANTHER”、“SNPs&GO”方法；最终，进行这些取舍之后，共计使用6种方法：PolyPhen、Provean、Panther、PhD-SNP、MutPred、SNPs_GO。
为了整合多种方法的结构，定义新的特征（Feature）：Harmful_Sum，这表明有多少个软件预测该突变是有害突变，Harmful_Sum=6表示这6个webserver都认为该突变有害。
接下来，对177种突变绘制Harmful_Sum条形图，Harmful_Sum值越高，在图上该突变条形越高，表明该突变更可能是有害突变。从图上可以看出不同方法预测为有害突变的比例各不相同，SNPs GO会将大部分的突变识别为有害突变；并且可以发现：594-597位的这一段区域的突变对蛋白质更可能有害。

图表 3 Harmful_Sum条形图
然后，标注不同位置所属区段，分别标注Activation Loop、Catalytic Loop、DFG Motif、P-Loop、MEK1结合、Raf结合区域，发现各个软件都预测有害的594-597这一段属于DFG Motif，DFG Motif对于BRAF“活性”与“非活性”转化非常重要。在非活性状态，F595占据着"nucleotide-binding pocket”，阻止ATP进入，降低酶活性，属于蛋白质结构中的关键部位。

图表 4 突变所属结构域
接下来，“分析突变对表型影响”与“突变所属蛋白质结构中部位”的关系。上传4MNE蛋白质复合体的pdb结构到“GETAREA”服务器，计算蛋白质各个氨基酸的溶剂可及面积，初步得到蛋白质的Inner，Outer区的分布。http://curie.utmb.edu/getarea.html
下图左为所有氨基酸“所属蛋白质结构的分布饼图”，可以看出来inner区和outer区各占1/3。
而如果对所有软件都预测是“有害突变”的位点做“所属蛋白质结构的分布饼图”，可以发现inner区的比例大大提高，超过50%，outer区的比例大大降低，只占10%。

图表 5突变所属蛋白质结构
不光如此，如果对inner区和outer区分别做Harmful_Sum的分布饼图，可以发现，Inner区有超过50%的突变是6个软件都预测为“有害突变”，而Outer区只有不到20%的突变是6个软件都预测为“有害突变”。（出现0.5是因为有的软件预测为benign，possibly damaging，probably damaging三种结果，则加分方式为0 0.5 1）

图表 6 Inner区和Outer区打分饼图
至此，可以得出第一个结论，预测软件显示，Inner区的突变更容易对蛋白质结构造成有害的影响。

四、突变对蛋白质稳定性影响

接下来，将177个突变全部依次用python脚本上传至IMutant、DUET、NeEMO、MAESTRO、MuPro服务器，计算突变对蛋白质稳定性的影响ddG，同时本地使用foldx计算突变前后的ddG。由于MuPro只给出稳定性的“增加/减小”的定性结果，没有给出ddG的具体数值，因而在后续画图中并没有使用。由于DUET服务器会使用“mCSM”“SDM”“DUET”三种计算方法，所以最后画图中会有7中方法计算的ddG。
对于177个突变计算出来的ddG绘制条形图(小于0表示降低稳定性)，可以发现SDM方法与其他方法计算的结果一致性最差。经过调研发现，SDM方法是基于“已知3D结构的同源蛋白质”之间的氨基酸变化，转化成“替代概率表”来进行计算，可能是受限于目前蛋白质结构解析量不足，其精度有限；也可能是该方法特点就是不会将很多突变识别为“稳定性降低”，导致一致性较差。
同时可以发现F595S突变稳定性下降最多(理由1)；而且在Uniprot中，也有关于F595突变致病的记录(理由2)；从结构上来看，突变由带着一个大苯环的苯丙氨酸，变为结构上较小的丝氨酸，变化相对较大(理由3)，再者，在非活性状态，F595占据着"nucleotide-binding pocket”，阻止ATP进入，降低酶活性，属于蛋白质结构中的关键部位(理由4)；除此以外，F595处于蛋白质的Inner区，其突变可能对蛋白质结构破坏较大(理由5)；并且在之前突变对蛋白质表型影响的分析中，F595S就被所有6个Web Server都认定为有害突变(理由6)。
基于以上理由，得出第二个结论，F595S突变严重破坏蛋白质稳定性，有潜在的致病性。

图表 7突变对蛋白质稳定性的影响

图表 8 Uniprot相关记录

五、突变对蛋白质亲和性影响

然后，将177个突变全部依次用python脚本上传至ELASPIC、BeAtMuSiC服务器，选出亲和力变化最大的前十个突变(理由1)，再筛选出在IBIS中显示的与MEK1的结合位点：G615R。

图表 9突变对蛋白质亲和力的影响
从结构可视化的突变中也可以看出来，G615R处于两者的结合位置。

图表 10 G615R位置
在MAPK信号通路中，Braf就是与MEK结合，引导下游的信号通路。(理由2)

图表 11 Braf信号通路
除此之外，MutaBind 服务器也显示ddG =1.02，结构更加不稳定；而且Chimera分析氢键网络，也显示氢键发生变化；从结构上，由甘氨酸变为碱性的精氨酸，酸碱性变化较大。(理由3)
综上所述，得出第三个结论，G615R突变影响Braf的氢键网络，导致与下游MEK1结合不稳定，进而紊乱信号通路。