独特的荧光染料——mFluor Green 620 琥珀酰亚胺酯
艾美捷mFluor™ Green 620 琥珀酰亚胺酯是一种独特的染料，可被 532 nm 的绿色激光很好地激发以产生红色荧光。mFluor™ Green 620 染料是水溶性的，使用 mFluor™ Green 620 染料制备的蛋白质偶联物是明亮的，斯托克斯位移约为 80 nm。mFluor™ Green 620 琥珀酰亚胺酯和偶联物是出色的绿色激光试剂，适用于流式细胞术研究和荧光成像应用。
艾美捷mFluor™ Green 620 琥珀酰亚胺酯准备解决方案：
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性使用的等分试样，并在制备后储存在 -20°C。避免重复冻融循环。
1. 蛋白质原液（溶液 A）
将 100 µL 反应缓冲液（例如，1 M 碳酸钠溶液或 1 M 磷酸盐缓冲液，pH ~9.0）与 900 µL 目标蛋白溶液（例如抗体，如果可能，蛋白浓度 >2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白质标记原液。
注意 蛋白质溶液（溶液 A）的 pH 值应为 8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的 pH 值低于 8.0，则使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸盐缓冲液将 pH 值调节到 8.0-9.0 的范围内。
笔记 蛋白质应溶解在 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.2-7.4。如果蛋白质溶解在 Tris 或甘氨酸缓冲液中，则必须对 1X PBS，pH 7.2-7.4 进行透析，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。
注意 不纯的抗体或用牛血清白蛋白 (BSA) 或明胶稳定的抗体不会被很好地标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。叠氮化钠或硫柳汞可以通过透析或离心柱去除以获得最佳标记结果。
笔记 如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，偶联效率会显着降低。为获得最佳标记效率，建议使用 2-10 mg/mL 的最终蛋白质浓度范围。
2. mFluor™ Green 620 SE 储备溶液（溶液 B）
将无水 DMSO 添加到 mFluor™ Green 620 SE 小瓶中，制成 10 mM 储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。
注意 在开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液 B）。及时使用。染料储备溶液的长期储存可能会降低染料活性。溶液 B 在避光和防潮的情况下可在冰箱中保存两周。避免冻融循环。
艾美捷mFluor™ Green 620 琥珀酰亚胺酯示例实验：
该标记方案是为山羊抗小鼠 IgG 与 mFluor™ Green 620 SE 的偶联物而开发的。用户可能需要进一步优化特定蛋白质。
注意 每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的特性。蛋白质的过度标记可能对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。
运行偶联反应
使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的 10:1 摩尔比作为起点：将 5 µL 染料储备溶液（溶液 B，假设染料储备溶液为 10 mM）添加到蛋白质小瓶中溶液（95 µL 溶液 A），有效摇动。假设蛋白质浓度为 10 mg/mL 且蛋白质的分子量为 ~200KD，则蛋白质的浓度为 ~0.05 mM。
注意 建议使用 10:1 摩尔比的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）。如果太少或太高，分别确定最佳染料/蛋白质比例为 5:1、15:1 和 20:1。
在室温下继续旋转或摇动反应混合物 30-60 分钟。
图：流式细胞术分析用（红色）或不用（绿色）1ug/ml抗人HLA-ABC生物素染色的HL-60细胞，然后用MFFluor™ 绿色620链霉亲和素结合物。
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