高分文献解读｜ceRNA绝对不过时，教你最牛的生信套路
领略高端套路，发表高分文章！
小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏。2021年的3月菠小萝陪您玩转科研~这一年的干货全部奉献给大家！本周，菠小萝继续推出“2021年必备生信套路|圆你的晋升梦”系列文献解读之——ceRNA绝对不过时，教给大家最牛的生信套路！牛年学习生信的热情也要牛上加牛呀！
（文章末尾有惊喜哦！）
今天菠小萝为大家带来的是2021年9月发表在《Mol Ther Nucleic Acids》上的环状RNA的ceRNA套路生信文章，最新影响因子8.986。题目是“Whole-Transcriptome Sequencing Identifies Key Differentially Expressed mRNAs, miRNAs,lncRNAs, and circRNAs Associated with CHOL”。
这篇文章的Figures都是我们非常熟悉的，也都是大家可以独立完成的，那我们也绝对可以发一篇5分+ceRNA套路的生信文章对不对！菠小萝保证大家学习过本篇推文后，人人都能掌握ceRNA套路。ceRNA套路虽然简单，但想要高分还是需要一些技巧的，比如如何选择数据来源，ceRNA其实涉及到的面非常广，简单的ceRNA网络只要有差异分子就可以构建。但要通过ceRNA网络发高分生信文章还是需要对数据的选择和富集分析的对象等等方面精挑细选的。下面菠小萝就通过这篇环状RNA的生信文章，为大家揭晓ceRNA的高分秘籍！感谢作者为我们提供了很好的学习典范！
期刊简介
“挑圈联靠”题目要素拆解
疾病：胆管癌(Chol)；
目的基因：Unknown；
数据来源：全转录组测序；
机制：ceRNA网络；
研究目的（文章类型）：Identify Key Differentially Expressed mRNAs, miRNAs, lncRNAs, and circRNAs，是一篇诊断/预后型生信文章。
知识背景
胆管癌是一种起源于胆道上皮的肿瘤，大多数CHOL患者预后不佳;手术切除是早期疾病患者的首选治疗选择，而不是晚期或晚期疾病患者，因为现有的全身治疗效果有限。因此，分子肿瘤生物学的进一步认识是非常有必要的。
近年来，相对于传统的桑格测序（Sanger Sequencing）而言，高通量测序(High-Throughput Sequencing，NGS)技术的发展使能够对整个基因组进行完全测序，并能够分析许多癌症基因组图谱。测序技术最大的优势就是可以发现新的基因！通过将目标DNA剪切为小片段，把单个小片段结合到固相表面，然后单分子独立扩增（每次只复制一个碱基并检测信号），最后高分辨率的成像系统，就完成啦！
高通量测序以其高输出量与高解析度的特性，不仅为我们提供了丰富的遗传学信息，而且使得测序的费用和时间大大缩短。在高通量测序发展的过程中，也有很多的问题需要我们去解决：数据在临床诊断上的作用，测序数据的储存和分析，数据的安全和信息隐私等。目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。
作者在本项研究中就是用了NGS，来获得不同类型的差异分子~本篇文章是一篇经典的竞争性内源RNA（ceRNA）假说套路文章，研究RNA之间互作机制。最常见的是microRNA能够通过与mRNA结合，从而导致功能RNA的沉默。反过来，具有相同microRNA结合位点的RNA分子能够竞争结合microRNA，从而实现RNA分子之间通过microRNA发生的调控作用。ceRNA分子包括mRNA、lncRNA、circRNA以及假基因。ceRNA串扰将破坏细胞过程和功能的平衡。
作者查阅文献得知，很少有研究使用全转录组测序策略来描述CHOL的转录组情况，全转录组测序策略允许对全球基因表达谱进行精确检测。在本项研究中，作者对8例CHOL患者的肿瘤(C组)及其对应的非肿瘤邻近肿瘤(CP组)进行了全转录组测序。随后对C组和CP组进行“挑”——差异mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA表达分析，并进行“圈”——功能相互作用预测分析。并构建ceRNA网络。最后，将得到的这一结果在TCGA)-CHOL数据集中进行验证。由此提出潜在的对CHOL的发生和进展的新的分子基础，并为明确的预后和治疗意义提供潜在的生物标志物。
数据来源 & 思路框架
作者选择了自己临床研究中心的8名CHOL患者(4名男性和4名女性;年龄范围:47-75岁，平均年龄60岁)的组织样本，这些患者术前无放疗、化疗。并以癌旁正常胆管组织作为对照，对两组进行差异表达分析，然后进行功能交互预测分析，研究CHOL中的基因调控回路。此外，CHOL数据的癌症基因组图谱(TCGA)用于验证结果。与对照组相比，CHOL样本共发现2895个差异表达信使RNA (Dif-mRNAs)、56个差异表达microRNAs (Dif-miRNAs)、151个差异表达长非编码RNA (Dif-lncRNAs)和110个差异表达环状RNA (Dif-circRNAs)。对与miRNA、lncRNA、circRNA相关的差异表达基因(DEGs)进行富集分析，也发现了剪接体的功能。例如，下调的hsa-miR-144-3p显著富集于竞争性内源性RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)复合物网络，该网络还包括7个上调和13个下调的环状RNA, 7个上调的lncRNA，以及90个上调和40个下调的mRNA。而且，大部分的DEGs和少数的miRNAs通过TCGA数据成功验证。参与RNA剪接和蛋白降解过程的基因以及miR-144-3p可能在CHOL的发病机制中发挥基础性作用。
数据精析
“挑”——差异表达分析
一般来讲，ceRNA套路都是要分别筛选差异mRNA、miRNA、lncRNA,如果有条件还可以再筛选差异circRNAs。本文就是分别筛选了这四种类型的差异分子。
按照筛选标准，共获得2895个便宜差异表达mRNA (Dif-mRNAs)，其中上调2290个，下调605个;鉴定出56个差异表达的miRNA (Dif- miRNA)，其中30个上调，26个下调;共获得151个差异表达lncRNA (Dif- lncRNA)，其中表达上调98个，表达下调53个;共发现110个差异表达的环状RNA (Dif-circRNAs)，其中30个上调，80个下调。DifmRNA、Dif-miRNA、Dif-lncRNA和Dif-circRNA的双向聚类热图如图1所示，肿瘤样本与对照样本可以显著分离，说明差异表达分析结果是可靠的。
（图1）
“圈” & “联”——分析DEGs的万能组合
1
功能富集分析
筛选了差异分子后，通常会对其进行富集分析。富集的是什么呢？是基因功能！也就是说无意义的分子是富集不到功能的。那些不编码蛋白的分子怎么办呢？不能用来富集的话，筛选这一步岂不是很没有意义了？并不是的，它们有靶基因呀~不能忘记靶基因发挥功能的途径。我们可以对其相应的靶基因进行功能富集，同样可以在一定程度上代表这些基因的潜在价值。
表达上调的基因富集于36条通路，图2显示了Dif- mRNA上调或下调后富集的Top 20通路。结果提示上调基因主要涉及“mRNA剪接”，通过剪接体，“rRNA处理”，“剪接体”，“RNA转运”。此外，下调基因与在“氧化还原过程”,“血小板脱颗粒”，“代谢途径”，“补体和凝血级联”。
（图2）
2
“联”蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络和模块提取
基于Dif-mRNA的PPI网络由421个节点和934个交互对组成。拓扑得分高的节点可视为网络的关键节点。使用Cytoscape的MCODE插件聚类到四个Hub模块，其中的基因均上调(图3A)。Module A (score=20.5)包含21个节点和205个相互作用对，其中核糖体蛋白包含最多，如核糖体蛋白L23a (RPL23A)、核糖体蛋白S11 (RPS11)和核糖体蛋白L8 (RPL8)。Module B (score=12.462)包含14个节点和81个相互作用对，包括小核糖核蛋白D2多肽(SNRPD2)、小核糖核蛋白E多肽(SNRPE)和小核糖核蛋白D1多肽(SNRPD1)。Module C (score=12)包含12个节点和66个互作对，其中基因属于蛋白酶体26S亚基家族，如蛋白酶体26S亚基，非ATP酶3 (PSMD3)和蛋白酶体26S亚基，非ATP酶13 (PSMD13)。Module D (score=12)包含13个节点和7个相互作用对，包括M相磷酸化蛋白10 (MPHOSPH10)和UTP6，小亚基过程成分(UTP6)。并对模块中的基因进行GO-BP富集分析(图3B)。
(图3)
3
miRNA、lncRNA和circRNA相关靶基因的富集分析
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