噬菌体展示文库构建全流程

1.什么是噬菌体展示

噬菌体文库是用于基因克隆的噬菌体载体，噬菌体展示文库是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用以筛选特异性蛋白或多肽的一项新技术。

2.噬菌体文库类型

卡梅德生物在抗体领域研究多年，我们构建的噬菌体展示技术服务涵盖了多种文库类型，包涵羊驼/骆驼VHH抗体库，人源噬菌体文库，人源SscFV抗体库，人源Fab抗体文库，噬菌体肽库，预制肽文库等多种优质的抗体库，可根据客户的需求提供定制服务，并提供灵活有效的筛选服务。

3.噬菌体文库筛选应用

噬菌体展示文库技术是一种新兴的生物技术，利用噬菌体展示技术获得的外源蛋白保持独立的空间结构和生物活性，目前在新型疫苗的研制，酶抑制剂的筛选，医学诊断和治疗，多肽药物的开发，抗原表位分析，单抗筛选，蛋白相互作用的研究等领域得到了广泛的应用，并显示了良好的应用前景。

4.噬菌体文库构建的技术优势

（1）筛选容量大、可发酵大量生产、方法简单，目前我们获得的噬菌体一级免疫文库的库容可达108-109，其序列丰度>99%，保证直接筛选获得的抗体亲和力达到nM甚至pM级别。

（2）将基因型与表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起，是一种筛选新技术。

（3）快速制备可溶抗原，结合公司现有的重组蛋白表达体系，能够在短时间内制备出高纯度、高生物学活性的可溶抗原蛋白，用以支持噬菌体抗体的免疫及筛选工作。

5.卡梅德生物能够为客户提供高质量的噬菌体文库构建服务

M13单链丝状噬菌体展示系统是目前应用较广泛的文库展示系统，通过将蛋白、抗体或多肽与噬菌体pIII蛋白融合表达，使之参与噬菌体组装，并展示在噬菌体表面，形成噬菌体展示文库，卡梅德生物利用M13丝状噬菌体壳蛋白pIII和PVIII展示技术，能够为客户构建不同物种的天然或者免疫的噬菌体抗体展示文库，通过抗体库技术制备多物种单克隆抗体，如人，鼠，兔，鸡，羊，鹅，猪，牛，马，驴，骆驼，羊驼，鲨鱼等物种来源的单克隆抗体，可根据客户的需求提供定制服务，并且库容量可达1011。

6.卡梅德生物为客户提供噬菌体文库构建服务的全流程介绍

卡梅德生物为客户提供噬菌体文库构建服务，流程包括：总RNA提取，反转录获取cDNA，PCR扩增，载体与 PCR 产物酶切连接，细菌文库构建，噬菌体文库构建，噬菌体文库效价检测。

6.1总RNA提取

将外周血淋巴细胞从冰箱取出后分装，加入氯仿，离心后取上清加入异丙醇，离心保留沉淀，加入75%乙醇后离心保留沉淀，干燥后加入DEPC水，孵育确保RNA溶解，将各管混合到一管中即为总RNA，取1μl总RNA进行电泳，取2μl用核酸浓度测量仪测浓度。

6.2反转录获取cDNA

按照商业化试剂盒操作说明书进行cDNA制备，将上一步得到的RNA一分为二反转录成cDNA，反转录引物分别用Oligo dTprimer及random 6-mers。

6.3PCR扩增

6.3.1第一轮PCR

以 cDNA 为模板进行第一轮PCR反应，使用HS Ex Taq酶进行PCR扩增。PCR反应体系为：

试剂	使用量
cDNA	0.5-5μl
AlpVh-L/CALL 002	2μl/2μl
dNTP Mix	4μl
10×ExTaq Buffer	5μl
HS Ex Taq	0.25μl
ddH2O	Up to 50μl

将得到的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，找到目的条带进行上述条件PCR扩增，将所有PCR产区进行1%琼脂糖凝胶电泳，使用通用型DNA纯化回收试剂盒对切胶的胶条进行DNA回收。

6.3.2 第二轮PCR

以上一步PCR扩增并回收后的DNA片段作为模板再次扩增特定的抗体片段，PCR 反应体系为：

试剂	使用量
第一轮 PCR 回收产物	0.1-2μl
Rvhh FP/RvhhRP	2μl/2μl
dNTP Mix	4μl
10×ExTaq Buffer	5μl
HS Ex Taq	0.25μl
ddH2O	Up to 50μl

将得到的PCR扩增产物使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收。

6.4载体与PCR产物酶切连接

第二轮PCR产物通过酶切连接到噬菌体质粒中，从而构建含有扩增片段的噬菌体质粒库。将连接产物使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收，分别取2μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度。

6.5细菌文库构建

将连接产物进行电击转化后构建含有目的抗体片段的大肠杆菌文库。

取大肠杆菌感受态细胞，加入回收后的连接产物，将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷好的电转杯中，使用电转仪预设的转化程序电击转化，电转后立即往电转杯中加入950μl SOC培养基，至少进行20个电转。将细胞复苏后涂在含有氨苄抗性的琼脂糖培养板上过夜生长。将上一步过夜生长后的培养板上的细胞用2xYT培养基和涂布棒冲洗刮下，加入20%的甘油测OD600nm值后保存在-80℃，即为细菌文库。

6.6噬菌体文库构建

6.6.1噬菌体文库扩增

将上一步刮下的菌体混匀后转移到100 mL预先加入抗生素的2x YT培养液中，37℃，250rpm培养直至合适的OD600nm值。

按照辅助噬菌体：细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体后继续37℃培养30分钟,加入合适终浓度抗生素，30℃过夜摇床培养。

6.6.2噬菌体文库制备

将过夜培养的细菌4℃ 4000 rpm离心20分钟，将上清转移到新的离心管后加入1/4体积预冷的的PEG/NaCl，在冰上孵育30分钟。4℃ 4000 rpm离心20分钟去除上清后加入PBS缓冲液溶解沉淀。再次加入合适体积预冷的PEG/NaCl后冰上孵育10分钟，4℃ 12000 xg离心10分钟后去除上清并将沉淀溶解在PBS中得到噬菌体库，长期-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存。

6.7噬菌体文库效价检测

将-80℃冰箱保存的菌株培养后，从单菌落板上挑取一个单菌落到 5ml 2×YT 培养基过夜培养。取制备好的噬菌体文库稀释12个梯度，每个梯度加入90μl 的宿主菌液培养，每个稀释管取5μl加到2×YT 固体培养基过夜培养，即可计算效价。

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