文献解读 | CTSE酶激活的AIE荧光探针运用于胰腺癌病理诊断

导读

胰腺癌是最严重的恶性肿瘤之一，五年生存率低于8%。开发准确、可靠的诊断技术对癌症治疗非常关键。然而，传统的组织学苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学（IHC）染色均存在操作复杂、耗时长的缺点，从而不能实现胰腺癌的术中病理学诊断（图1A）。近年来，聚集诱导发光材料（AIEgens）因具有良好光稳定性、高分辨率和长期跟踪能力，被广泛用于实时和原位成像。但是，目前AIEgens探针的开发仍存在特异性靶向能力差、细胞/组织穿透性的低等瓶颈，无法在活体组织中得到更好的应用。

为了解决以上问题，华东理工大学朱为宏课题组基于早期提出的“双亲性AIE”设计策略（National Science Review），在Advanced Materials期刊上发表了题为An Enzyme-Activatable Aggregation-Induced-Emission Probe: Intraoperative Pathological Fluorescent Diagnosis of Pancreatic Cancer via Specific Cathepsin E（IF：30.849）的文章。

在该工作中，作者以早期发展的AIE母体喹啉腈（QM）衍生物QM-COOH作为荧光报告基团，引入组织蛋白酶E（CTSE）响应的肽链Ala-Gly-Phe-Ser-Leu-Pro-Ala-Lys-Arg （简写为HSP）以及水溶性的穿膜肽（Arg8，简写为CPP），构建了双亲性激活型AIE探针QM-HSP-CPP （图1B）。由于穿膜肽的引入该探针在水溶液中保持荧光关闭状态，当与CTSE响应后，探针水溶性下降，发生聚集，产生荧光，从而实现对CTSE的实时检测（图1C）。由于CTSE过表达于胰腺癌，且随着癌变程度增加，表达量增高（图1D），因此该探针可以用于胰腺癌的诊断。

图1. 设计AIE激活型探针QM-HSP-CPP，通过CTSE实现对胰腺癌临床可视化诊断。（A）目前临床切片的诊断方法，（B）设计CTSE酶激活型AIE探针QM-HSP-CPP。（C）探针QM-HSP-CPP对CTSE响应的示意图。（D）从TCGA数据库中获得正常胰腺组织和各种晚期胰腺组织中CTSE的表达。

紧接着作者对探针QM-HSP-CPP以及参比探针QM-HSP的光谱性质进行了研究。结果表明，HSP的引入不能改变QM-COOH的水溶性，参比探针仍然表现出典型的AIE特征（图2 A和D）。与之相反，引入穿膜肽CPP之后，探针QM-HSP-CPP在各种溶剂体系中均因良好的分散性而表现出荧光关闭状态（图2B、C、E和F）。根据分子内旋转受限的发光机理，作者研究了探针QM-HSP-CPP在黏度增加的情况下探针的发光性质，可以看出探针在黏度增加时也表现出荧光增加，表明探针QM-HSP-CPP仍然具有AIE的特性（图2 G和H）。良好的光稳定性是实现长时间高保真成像的基础，基于此，作者研究了系列探针的光稳定性。可以发现，相对于市售的参比探针，QM系列探针均具有优异的光稳定性（图2I）。

图2. 探针QM-HSP于QM-HSP在不同溶剂体系中的光谱性质。（A）探针QM-HSP（10-5 M）在DMSO-Water混合体系中的发光光谱（λex = 447 nm）。(B,C)探针QM-HSP（10-5 M）在DMSO/EtOH-Water混合体系中的发光光谱（λex = 447 nm）。QM-HSP（D）和QM-HSP-CPP（E和F）在不同混和体系中I/I0值与水含量的关系曲线。探针QM-HSP-CPP在甘油-水体系中的光谱（G），以及对应的I/I0值与水含量的关系曲线（H）。（I）QM系列探针以及ICG染料的光稳定性测试。

在研究清楚探针QM-HSP-CPP的光谱性质之后，作者进一步研究了探针对CTSE的体外响应情况。结果显示在响应体系中没有加入CTSE时，探针QM-HSP-CP表现出荧光关闭状态，几乎没有变化（图3 A和E）。酶浓度达到50 pmol/mL时，随着孵育时间增加，荧光逐渐上升，表明探针QM-HSP-CPP可以实现对CTSE的激活型响应（图3B和F）。紧接着，为了研究不同取代肽链部分对CTSE的响应，作者研究了探针QM-HSP以及QM-CPP对CTSE的响应。结果显示，由于QM-HSP在水溶液中自身就处于荧光开启状态，因此在加入CTSE后，其荧光变化不明显，表现出些许下降（图3C和G），下降可能是因为探针聚集发生沉淀导致。此外仅由穿膜肽CPP取代的探针QM-CPP，其在光物理特性与QM-HSP-CPP类似，然而在酶响应实验中，该探针对CTSE并没有任何响应（图3D和H）。这表明穿膜肽的引入可以有效提升探针溶解性，此外也表明HSP片段的引入是实现对CTSE酶响应的关键。关于探针的酶切机理，作者通过响应后质谱得到验证（图3I）。而且，选择性实验也表明探针对CTSE酶具有很好的选择性（图J）。

图3. CTSE原位激活QM-HSP-CPP的AIE信号。（A和B）QM-HSP-CPP对CTSE（0/50 pmol/mL）随着时间变化的荧光响应。（C和D）参比探针QM-HSP和QM-CPP对CTSE（50 pmol/mL）的响应。（E-H）I/I0相对时间的关系曲线。I高分辨质谱对酶切响应的机理验证。（J）探针的选择性实验。

紧接着作者研究了探针对胰腺癌细胞（SW990）的响应情况（图4A）。结果显示，引入穿膜肽之前探针QM-HSP无法进入细胞（图4B），而引入穿膜肽之后探针QM-HSP-CPP具有很好的穿膜效应，实现了对胰腺癌的激活型检测（图C和D）。此外作者还研究了探针QM-HSP-CPP对正常胰腺细胞（MS1）的响应，结果也表明探针可以有效区分胰腺癌细胞和正常胰腺癌细胞，具有用于胰腺癌检测的潜力。

图4. 高效的跨膜效率实现对内源性CTSE的原位响应。（A）CTSE诱导的AIE荧光释放实现对胰腺癌细胞检测示意图。（B和C）探针QM-HSP和QM-HSP-CPP与SW1990细胞孵育不同时间的荧光成像照片。（D）随着时间变化细胞内归一化荧光强度。（E）探针QM-HSP-CPP对胰腺癌细胞和正常胰腺细胞的区分。

在探究了探针QM-HSP-CPP对胰腺癌和正常胰腺细胞的区分能力之后，作者进一步研究了探针在临床样本病理学检测的可能性。首先作者通过H&E以及免疫组化（IHC）实验验证了癌组织和癌旁组织石蜡切片，结果表明CTSE过表达于癌组织（图5A）。紧接着作者研究了免疫荧光染色（IF）和探针QM-HSP-CPP染色对癌组织和癌旁组织冰冻切片区分能力。结果表明IF染色并不能很好的区分癌组织和癌旁组织。相反，探针QM-HSP-CPP在癌组织的荧光强度却是癌旁组织的9.3倍（图5B），这表明探针QM-HSP-CPP可以通过CTSE有效区分癌组织和癌旁组织，有望实现对胰腺癌的检测。同时，共聚焦成像实验也表明探针QM-HSP-CPP不仅可以实现对癌组织的识别，并且具有很好的癌组织的穿透能力（图5C和D）。

图5. 术中病理学诊断胰腺癌切片。（A）H&E和IHC染色用于区分癌组织和癌旁组织切片。（B）IF和QM-HSP-CPP对冰冻切片的染色成像（C和D）冰冻切片的CLSM成像。

最后小鼠实验表明探针QM-HSP-CPP可以实现对胰腺癌模型小鼠的肿瘤靶向和激活型荧光响应（图6），有望应用于荧光介导的手术导航。论文作者为华东理工大学博士生朱志荣，通讯作者为华东理工大学朱为宏教授和王琪副教授。该文章得到了上海交通大学医学院陈晓炎医生的大力支持。

题目：An Enzyme-Activatable Aggregation-Induced-EmissionProbe: Intraoperative Pathological Fluorescent Diagnosis of Pancreatic Cancer via Specific Cathepsin E

期刊：Advanced Materials

影响因子：30.849

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武汉爱博泰克生物科技有限公司（ABclonal Technology Co.,Ltd.）成立于2011年，作为生命科学解决方案的提供商，旨在为更多的科研工作者、IVD企业、新技术开发企业提供抗体、酶、NGS产品和蛋白制品等全套解决方案。

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