体外脑细胞在培养皿中“打游戏”

今年 9 月，Neuron 发表了这样一项有趣的研究：体外神经元在模拟游戏世界中能够学习并表现出感知能力。在这项研究中，Kagan 和他的团队开发了 DishBrain 系统 (一种在结构化环境中能利用神经元固有的自适应计算能力的系统)。

研究者们将 hiPSC 或 E15.5 小鼠胚胎的原代皮层细胞中提取的神经元电镀到高密度多电极阵列 (HD-MEAs) 芯片上，并通过 DishBrain 系统嵌入到类似街机游戏的 “Pong” 中。DishBrain 系统可以从神经培养中 “读取” 信息 (记录神经元在培养中的电活动)，又能将感官数据 “写入” 到神经培养中 (即给神经元提供非侵入性的 “感觉” 电刺激)。并通过改变感官信息的模式，创造了不同的 “DishBrain” 环境，使神经元做出不同的响应 (类似于神经元网络中活动产生的动作电位)。

图 1. DishBrain 系统和实验方案示意图[1]

研究结果表明，在这个 DishBrain 系统，人类和小鼠的神经元在一个碟子里学会了玩电子游戏 “Pong” 。皮质神经元可以自我组织活动，在模拟游戏世界中显示智力和有 “感觉” 的行为，并随着时间的推移改变它们的行为。这项研究在扩展当前对大脑如何工作、智力如何产生的理解方面具有重要意义。

图 2. DishBrain 中的神经细胞阵列正在工作[2]

不同颜色标志着不同类型的神经细胞及其组成成分。图片来源:皮质实验室

对于 “脑” 的研究，前进的脚步从未停止，上述研究让 #首次证明人脑细胞在体外也有智力#、#人脑细胞在培养皿中打游戏# 等词条一度火上微博热搜。

就在前几天，Nature 于 10 月 12 日在线发表的题为 Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids 的研究性文章，更是打开 “脑” 研究的新纪元。

“人鼠脑” 融合，脑疾病研究新途径

• 关于 “人鼠融合脑”

在这里，首先复习下什么是类器官：由原代组织、ESCs 或 iPSCs 衍生而来的体外 3D 细胞簇，它们具有自我更新和自组织能力，并表现出与起源组织相似的器官功能 (可戳前文：类器官——从 2D 到 3D 的进阶)。从多能干细胞生成层压的大脑皮层样结构，称为人类皮质球体 (hCSs)。hCSs 包含来自深层和浅表皮质层的神经元，这些神经元在电生理上成熟，能表现出自发活动，被非反应性星形胶质细胞包围并形成功能性突触。皮质神经元参与神经网络活动并产生复杂的突触事件[3]。

hCSs 在培养皿中 (体外) 大概长下面这样~

图 3. 人类皮质球体[3]体外培养第 13 天、第 26 天和第 61 天后 hCSs 的形态和大小

• 成功移植人类皮质球体 (hCS) 至鼠脑

这个研究中，作者团队将类器官 “玩” 出了新花样：首先将完整的体外 3D 人类皮层类器官 (human cortical organoids, hCO) 立体定向移植到出生后 3-7 天的早期无胸腺大鼠的 S1 区 (初级体感皮层 S1 区，特异性投射系统的高级神经中枢；该区域可以接收来自鼠感觉器官的信号，然后将它们传递到大脑区域) (图 4a)，整合为 t-hCO (transplanted hCO)。移植后约 2 个月，在 81% 的移植动物中鉴定到了 t-hCO (n=72)，并且有 87% 位于大脑皮层 (图 4b)。核磁共振成像 (MRI) 结果表明，t-hCO 在 3 个月内体积增加了 9 倍 (图 4d)，并且移植后 12 个月，移植动物的存活率也很高 (74%)。

小 M 偷偷感叹：大制作啊，且不说技术牛轰轰，光是实验造模的时间都体现出了对科研的热爱~

图 4. 在发育中的大鼠皮质中移植人类皮质类器官[4]

a. 实验设计原理图。b. 移植2个月后 S1 区 t-hCO 的 MRI 图像。c. hiPS 细胞系移植成功率的量化。

d. 3 个月后的冠状位 MRI 图像。

• t-hCO 的细胞结构和细胞组成

移植成功的 t-hCO 的细胞组成具体是什么呢？体内生长的 t-hCO 又与体外的 t-hCO 有何不同？

免疫染色结果显示 IBA1 的染色 (小胶质细胞) 充满整个移植物，此外 t-hCO 中不仅存在大鼠小胶质细胞 (图 5a)，还存在皮质祖细胞、神经元、神经胶质细胞以及少突胶质祖细胞。研究者们还确定了 t-hCO 中主要表达皮质细胞类别的簇，包括深层和表层谷氨酸能神经元、循环祖细胞等细胞 (图 5b)。差异基因表达分析结果还发现 t-hCO 神经元成熟相关的基因组的上调 (例如突触信号传导、树突定位和电压门控通道活性) (图 5c)。

小知识：谷氨酸能神经元是一类能释放兴奋性递质谷氨酸 (Glutamate) 到突触间隙，产生兴奋性突触后电流的神经元。中枢神经系统中重要的兴奋性神经元。

图 5. t-hCO 的细胞结构和细胞组成[4]

a. t-hCO的代表性免疫细胞化学图像；PPP1R17 (皮质祖细胞)，NeuN (神经元)，SOX9 和 GFAP (胶质细胞) 或 PDGFRα (少突胶质细胞)。b. snRNA-seq。c. 基因本体论术语 (GO terms) 富集分析。突触 (Synapse)、树突 (Dendrite)、突触信号 (Synaptic signaling) 为显著富集的前三个 terms。

研究者们还发现，t-hCO 神经元相当大，总树突长度比体外 hCO 增加六倍，树突棘密度也显著高于 hCO 神经元 (图 6a-b)。此外，t-hCO 的谷氨酸能神经元簇与成人 L2/3、L5 和 L6 神经元亚类重叠，例如，与体外 hCO 神经元相比，灵长类动物特异性活性调节基因 (BDNF18、SCG2 和 OSTN) 在 t-hCO 神经元中的表达增加，这表明 t-hCO 具有人类皮层神经元高级形态和功能特征。

图 6. t-hCO 与体外的 hCO 并不相同[4]

a. hCO 和 t-hCO 神经元的 3D 重建。b. 形态特征的量化。c. 分化 8 个月时，hCO 和 t-hCO 的 3D 重建树突状分支。d. hCO 和 t-hCO 神经元中的自发 EPSCs。

• t-hCO 适用于揭示人类疾病

既然 t-hCO 能够重现人类皮层神经元高级形态和功能特征的能力，那么 t-hCO 是否可用于揭示疾病表型？ 以蒂莫西综合征 (Timothy Syndrome, TS) 为例，研究者们将 TS 患者和对照参与者的来源的 hCO，移植至大鼠 (图 7a)，与对照相比，TS hCO 树突形态发生了改变，具有异常的树突分支模式 (图 7b)，这种分支异常的模式，与作者团队以前关于 TS 疾病的研究结果一致。而且这种异常的分支模式，在类似分化阶段的体外 TS hCO 中没有表现出来 (图 7c)。由此可见，通过将人脑组织植入大鼠体内来揭示疾病表型，十分可行。

图 7. t-hCO 中的高级神经元特征揭示了人类皮层神经元中活动依赖性疾病表型[4]

a. 将对照和 TS hiPS 细胞系产生的 hCO 移植到新生大鼠体内。b. 对照组和 TS 组 t-hCO 神经元的三维重建。c. hCO 和 t-hCO 中 TS 和对照神经元的 shell 分析。

• t-hCO 在大鼠体内的成功融合

那么 t-hCO 细胞在多大程度上融入了大鼠 S1？以及 t-hCO 是否可以在活体环境下被感官刺激激活？ 用改造的腺相关病毒 rabies-dG-GFP/AAV-G 感染 hCO，并移植到大鼠 S1 中。在移植后 7-14 天，可以在鼠脑观察到同侧 S1 和腹基底核神经元中密集的绿色荧光蛋白 (GFP) 表达 (图 8b-c)。为了评估在 t-hCO 细胞中是否可以引起突触反应，电流刺激大鼠 S1、内囊、白质、t-hCO 中附近的纤维，可诱发 t-hCO 神经元中的短潜伏期兴奋性突触后电流事件 (excitatory postsynaptic current events, EPSCs)，且 AMPA 受体拮抗剂 NBQX 可将其阻断 (图 8f-g)。这表明 t-hCO 在解剖学上成功整合到大鼠大脑中，成为了它的一部分！

图 8. 移植的 hCO 接收与感觉相关的输入[4]

a. Rabies-tracing 实验示意图。b. t-hCO 和大鼠皮层之间的 GFP 和人 STEM121 表达。c. GFP 表达细胞的定量。d-e. t-hCO 中 Netrin G1+ 丘脑末端。f-g. 大鼠 S1 或者内囊电刺激后 t-hCO 神经元的电流痕迹。

• t-hCO 激活大鼠神经元以驱动大鼠寻求奖励的行为

那么，t-hCO 是否可以在活体环境下被感官刺激激活？最最最惊险的部分来了！

为了研究了 t-hCO 是否可以激活大鼠的神经电路来驱动行为，研究者将表达 hChR2-EYFP 的 hCO 移植到 S1 中，将光纤植入 t-hCO 中进行光传输。然后，对大鼠进行改良的操作性条件反射范式训练 (图 9a)。将动物放入行为测试室并随机交错呈现蓝色和红色激光刺激。如果动物在蓝光刺激期间舔舐，动物会获得水奖励，但如果它们在红光刺激期间舔舐则不会。

在训练的第一天，无论是蓝光还是红光刺激，动物的舔舐行为都没有差异。然而，在第 15 天！大鼠学会了把蓝光刺激和喝水联系了起来。移植了表达 hChR2-EYFP 的 hCO 的动物在蓝光刺激期间表现出更多的舔舐。移植了表达对照荧光团的 hCO 的对照动物中未观察到这些舔行为的变化 (学习成功率：hChR2 89%，EYFP 0%，图 9b-e)。这表明植入的人脑类器官已经真正参与了大鼠大脑的工作，t-hCO 细胞可以激活大鼠神经元以驱动寻求奖励的行为。

图 9. 移植的 hCO 在大鼠神经元上

建立功能性连接并调节行为[4]

a. 行为任务的示意图。b. 实验动物在训练第 1/15 天的表现 (红蓝光试验累积舔舐次数)。c-d. 移植 t-hCO 表达 hChR2-EYFP 荧光团的的行为表现。e. 偏好评分的演化。

总结

这项研究建立了人脑类器官与实验动物连接的新模型，与单纯的体外培养或构造动物疾病模型相比相比，利用老鼠脑内环境培育的人类器官更能还原疾病环境、更贴合实际疾病的情况，这让后续模拟实验变得更准确，进而帮助人们研究与治疗自闭症等神经类疾病。

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参考文献

1. Brett J Kagan, Andy C Kitchen, Nhi T Tran, et al. In vitro neurons learn and exhibit sentience when embodied in a simulated game-world. Neuron. 2022 Sep 20; S0896-6273(22)00806-6.

2. Heidi Ledford. Neurons in a dish learn to play Pong — what’s next? Nature News. 12 October 2022.

3. Anca M Paşca,1,13 Steven A Sloan, Stephen J Smith, et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 2015 Jul;12(7):671-8.

4. Omer Revah, Felicity Gore, Kevin W Kelley, et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 2022 Oct;610(7931):319-326.