【Int. J. Mol. Sci.】猕猴桃果实成熟相关基因AaPG18的表征和鉴定
文章信息
题目：Characterization and Identification of a Ripening-Related Gene AaPG18 in Actinidia arguta
刊名：International Journal of Molecular Sciences
作者：Yukuo Li, Xiujuan Qi et al.
单位：Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences
日期：26 February 2022
摘要
1
Actinidia arguta ( A. arguta ) 是一种呼吸跃变水果，会迅速软化并限制水果的保质期和商业价值。因此，开发具有延长果实保质期的猕猴桃品种具有重要意义。然而，A. arguta的成熟和软化机制仍不清楚。在这里，我们证明了一个关键的多聚半乳糖醛酸酶 (PG) 编码基因AaPG18通过细胞壁的降解参与了A. arguta的成熟。在三个发育阶段（S1、S2 和 S3）收获水果进行高通量转录组测序，基于这两个候选转录本c109562_g1和c111961_g1被筛选。PG 基因家族的全基因组鉴定指定c109562_g1和c111961_g1分别对应于AaPG4和AaPG18。果实采前六个阶段候选基因的表达谱显示AaPG18的表达水平明显高于AaPG4 ，表明AaPG18可能是果实成熟过程中的关键基因。亚细胞定位显示AaPG18位于细胞质膜上。AaPG18在草莓中的短暂过表达和以下形态学观察表明AaPG18对维持细胞形态的稳定性起到关键作用。A. arguta “RB-4”中的同源瞬时转化证明了AaPG18在果实成熟过程中的关键作用，它导致果实快速变红，这是果实成熟的指标。总而言之，我们的研究结果将AaPG18确定为参与细胞壁退化的关键候选基因，这为后续探索A. arguta果实成熟和软化的分子机制提供了基础。
技术路线
2
主要结果
3
3.1 果实不同采前阶段的生理变化
为了调查“TY”果实的成熟状态，对来自六个收获前阶段的样品进行了果实硬度、可溶性固形物含量和呼吸强度的评估。果实硬度随着成熟过程逐渐降低（图1A），而可溶性固形物含量呈上升趋势（图1B）。相反，呼吸强度呈锯齿形，先下降后上升（图1C）。上述指标的变化可能与果实成熟过程中的剧烈变化有关。
3.2 基于转录组分析的候选基因筛选
果肉样品在三个关键阶段的转录组分析表明，大量基因在果实成熟过程中强烈表达。三个比较，S2 与 S1、S3 与 S1 和 S3 与 S2，用于寻找候选基因。在这三个比较中，共有 4619 个差异表达基因 (DEG) 共表达（图2A ，表 S1），其中 659 个差异表达基因在每个连续的时间点都上调（图2B ）。通过将转录本的设置为五倍变化作为筛选阈值来筛选果实成熟期间最重要的 DEG。最后，两个转录本 c109562_g1 和 c111961_g1 被鉴定为潜在的候选基因（图 2C）。这两个转录本的表达水平在 S3 中显着高于在 S1 中的表达水平（图2D）。两种转录本在不同的在线数据库（KO、Swissprota 和 MF）上都被注释为 PG（图 2 E）。
3.3 猕猴桃中PG家族的鉴定与分类
对 PG 家族进行了全基因组鉴定，以发现 c109562_g1 和 c111961_g1 与其他家族成员的密切关系。从猕猴桃“R5”基因组中共挖掘出52个PG家族成员。染色体分布显示这52个PGs不规则地位于20条不同的染色体上，包括染色体02、03、05、06、07、08、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、 23、28和29号，5个成员分布在12、17和29号染色体上，其余成员分布在11、13、14、16、20、22和23号染色体上（图S1 ）。进行了结构分析、系统进化、域组织和保守基序分析，以找出 c109562_g1 和 c111961_g1 的密切相关的 PG 家族成员。将52个PG进一步分为A、B、C、D、E和F六个亚家族。通过测序和同源性比较，我们发现c109562_g1和c111961_g1分别对应于AaPG4和AaPG18。此外，AaPG4 和 AaPG18 聚集成亚家族 A（图 S2）。AaPG4和AaPG18的表达水平通过 qRT-PCR 评估六个收获前阶段的样品中的含量。结果表明，这两个基因都在果实发育过程中表达。除了AaPG18在104 d低表达外，应该是准备下一个成熟的阶段，随后AaPG18的转录水平在111、118和125 d呈现增强趋势。总的来说，在果实成熟的整个过程中，AaPG18的转录水平显着高于AaPG4，表明AaPG18可能在果实成熟过程中发挥重要作用（图3）。
3.4 一种膜定位的 AaPG18 蛋白
通过在线工具 PSORT，预测 AaPG18 蛋白在植物中的亚细胞定位。预测了它在细胞质膜中存在。为了进一步确定这一预测结果，我们以两种不同的方式分析了推导的 PG18 氨基酸序列，以找出跨膜结构域。正如预期的那样，推导的 AaPG18 蛋白中有两个 N 端跨膜结构域（图 4 A-D）。为了获得其在植物细胞中定位的直接证据，将亚细胞定位的构建体引入本氏烟草树叶。GFP 荧光信号仅在注射 35S:AaPG18-GFP 的叶片的细胞质膜中检测到，而在注射对照 (35S:GFP) 的叶片的核和膜中均观察到，这证实了我们最初的预测，即 AaPG18可能是一种膜定位蛋白，在细胞外层起作用（图 4 E）。
3.5 草莓中 AaPG18 的瞬时过表达
为了探索AaPG18的基因功能，采用单果对照的方法在草莓中进行瞬时过表达（图5A）。注射pBI121-AaPG18的一侧在浸润区域显示出明显的灰褐色，而仅注射pBI121或根本不注射的水果的另一侧则没有任何反应（图5B ）。为了在细胞水平上找到这种差异现象背后的原因，浸润的组织切片用甲苯胺蓝染色。AaPG18过表达的果实侧的横截面呈现出细胞的规则和平坦状态（图5C），而与对照渗入或完全未渗入的果实切片的细胞形状不规则且松散（图5 D，E），这表明AaPG18在细胞壁稳定性中起关键作用，它有助于细胞以维持其形态。
3.6 猕猴桃中AaPG18的同源瞬态转化
同源转化被认为是研究基因功能的最佳方法之一。为了了解 AaPG18 在猕猴桃中的作用，使用信号果实控制方法在A. arguta “RB-4”中进行了瞬时过表达。注射 pBI121–AaPG18 的果实一侧变红（图 6 A），而被空载体浸润的一侧没有任何东西出现（图 6 B）。在过表达 AaPG18 的“RB-4”中出现红色表明它参与了果实成熟。因此，这些明显的表型结果证实了 AaPG18 在果实成熟和软化中的关键作用。qPCR 结果显示，与 pBI121 浸润的另一侧相比，pBI121–AaPG18 浸润的果实侧的 AaPG18 表达水平显着更高（图6C ）。
结论
4
在这项研究中，我们通过生理检测结合基于转录组学方法的分子研究，筛选并鉴定了一个PG编码基因AaPG18 。亚细胞定位显示 AaPG18 是一种膜定位蛋白，在细胞外层起作用。草莓和猕猴桃中的异源和同源过表达证实了AaPG18在果实成熟和软化过程中的功能作用。目前的研究将帮助研究人员进一步探索水果成熟和软化的复杂机制，并开发具有延长水果保质期的品种。
果实成熟是一个极其复杂的过程，它涉及一系列酶活性的动态变化和基因差异表达的调控。许多参与这一过程的基因已在不同物种中被克隆和鉴定。除了上面提到的 PG 基因外，许多 TF 还可以参与果实成熟和软化的调控。许多 TF，如 MYB、bHLH 和 NAC，已被确定为控制果实成熟和软化的重要调节剂。我们的研究特别关注细胞壁降解的一个关键功能基因，这是果实软化和成熟的重要现象。因此，我们将对AaPG18的上游调节剂进行筛选在我们随后的研究中探索成熟机制的调控网络。
获取原文
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原文链接：
https://www.mdpi.com/1422-0067/23/5/2597/htm#fig_body_display_ijms-23-02597-f002
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