纯净的细菌培养株对于微生物组研究中的详细实验和机理研究仍然是必不可少的，单从复杂的微生物生态系统中分离单个细菌的传统方法是劳动密集型的，很难达到规模，并且缺乏表型-基因型的整合。

近期发表在《Nature Biotechnology》的文章，描述了一个高通量机器人菌种分离平台，可以按需快速生成分离株。该研究开发了一种机器学习方法，利用菌落形态学和基因组数据，最大限度地提高分离的微生物的多样性，并能有针对性地挑选特定的属。

在20个人类的粪便样本上应用这一平台，产生了个性化的肠道微生物组生物库，共有26,997个分离物，占所有丰富分类群的80%以上。对>100,000个视觉捕获的菌落进行空间分析，揭示了 Ruminococcaceae, Bacteroidaceae, Coriobacteriaceae和Bifidobacteriaceae之间的共生模式，表明了重要的微生物相互作用。对来自这些生物库的1197个高质量基因组的比较分析显示了有趣的菌种内和菌种间进化、选择和水平基因转移。这个培养学框架可以使基于成像的表型的收集和定量分析与高分辨率的基因组学数据系统化，用于许多新兴的微生物组研究。

自动微生物组成像和分离的培养学（CAMII）的平台

在常规的分离培养实验室中，使用视觉特征的选择性菌落挑选通常是定性的，没有标准化，结果在不同的实验和实验者之间可能有很大的不同。为了解决这些缺点，设计了一个被称为自动微生物组成像和分离的培养学（CAMII）的平台，将培养学与形态学和基因型数据系统化，用于菌落分离和功能分析（如图1所示）。

图1. 使用表型和形态学特征的数据驱动的微生物分离策略

CAMII平台由四个关键因素组成（图1a）：(1）收集菌落形态数据的成像系统和人工智能指导的菌落选择算法；（2）用于高通量分离和排列分离物的自动菌落采摘机器人；（3）为采集的分离株快速生成基因组数据的低成本管道；（4）具有可搜索菌落形态、表型和基因型信息的物理分离株生物库和数字数据库。

这个端到端的培养学平台可以用最小的手工劳动从不同的输入微生物组中产生分离物集合。整个成像和分离系统是使用现成的组件建立的，安置在一个厌氧室中，对温度、湿度和氧气水平进行实时控制（图1b）。CAMII机器人的隔离能力为每小时2,000个菌落，每次可处理12,000个菌落，这比人手动隔离菌落的能力高20倍以上，速度也快。为了确保基因组分析能力与机器人的分离吞吐量相匹配，还开发了一个低成本、高吞吐量的测序管道，利用液体处理自动化生成条形码文库，用于16S rRNA测序或全基因组测序（WGS）。在这个管道中，每个分离物的成本是0.45美元用于菌落分离和基因组DNA（gDNA）制备，0.46美元用于16S rRNA测序，6.37美元用于在Illumina HiSeq平台上覆盖率大于60倍的WGS，这比商业服务便宜很多。

CAMII平台的一个关键的独特功能是收集细菌菌落的形态学数据并从中学习的成像系统（图1c）。具体来说，透光图像（显示菌落的高度、半径和圆度）和外照射图像（显示颜色和复杂的形态学特征）在CAMII上被捕获，产生一个多维和可量化的形态学数据集。开发了一个定制的菌落分析管道，沿着不同的形态特征对菌落进行分割。面积、周长和平均半径反映了菌落的大小，而圆度、凸度和惯性显示了菌落的形状。红、绿、蓝（RGB）通道的像素强度及其变异突出了整个菌落的任何密度梯度和颜色（图1d）。接下来推断，形态不同的菌落更有可能是系统发育上的多样性，这可以用来改善菌落的隔离。

生成个性化的肠道分离株生物库

虽然来自不同人的微生物组可能共享相似的细菌物种集，但属于这些物种的菌株对个人来说是非常独特的，并可能在同一宿主身上共同寄居多年。我们试图展示CAMII的效用，为20个健康人生成个性化的肠道分离株集。共目测分析了102,071个菌落，挑选了26,997个菌落，通过16S rRNA测序进行分类鉴定（图2a），产生了394个独特的ASVs，涵盖了健康共生肠道微生物组的广泛多样性（图2b,c）。

图2. 20个人生成个性化的肠道分离株生物库

对分离物收集和粪便样本的比较表明，大多数高丰度和流行的ASVs在收集中至少被分离一次。此外，每个个性化的分离株收集都与粪便样品相似，具有可比性的微生物组分布和香农多样性指数。

识别培养不足的“暗物质”肠道微生物

以前的研究已经观察到，许多来自不同环境的微生物很难在实验室中培养。因此，利用该系统生成的分离物生物库来评估人类肠道微生物组的可培养性，并确定在我们的实验环境中仍然难以分离的细菌ASVs。在所有20个个性化的分离株集中，确定在生物库中是否发现大量粪便中丰富的ASVs（平均相对丰度>0.1%）。值得注意的是，相当一部分未培养的肠道细菌属于Ruminococcaceae和Lachnospiraceae家族（图2e），这在以前也被记录为“不可培养的”。对于每个ASV，比较了在我们的总分离株集中产生的分离株的数量与它们在粪便中的平均丰度（图2f），这似乎是正相关的。尽管如此，还是发现了一组丰富但难以培养的细菌，包括Faecalibacterium ASV-58、Prevatella ASV-470和ASV-324、Oscillibacter ASV-215和Clostridium XlVa ASV-287（图2g）。有趣的是，从中获得了一个分离株并进行了WGS，与Candidatus cibiobacter qucibialis的宏基因组组装基因组（MAG）的全基因组平均核苷酸一致性（ANI）大于98%。我们收集的这一菌株以前被报道为人类肠道中最丰富的未培养物种，在炎症性肠病（IBD）患者中高度枯竭，其他粪肠杆菌菌株也是如此。

从形态学上预测分类，可以有针对性地进行分离

从微生物组样本中集中培养感兴趣的细菌，对机理研究至关重要。不幸的是，我们缺乏以特定方式选择性地培养大多数细菌物种的能力。因此，挑选大量的菌落并依靠统计学概率是获得感兴趣的细菌的唯一实际解决方案。然而，这种策略往往过于耗费资源，因为它可能需要手动挑选成千上万的菌落。CAMII提供了一种ML指导的自动菌落选择方法，基于将分类学身份与菌落形态联系起来，因此在理论上可以加强目标分离。

图3. 使用菌落形态学预测分类群身份，加强了目标分离

为了测试这一点，系统地探测了深层肠道分离株集，分析了形态学和基因型数据之间的关系。有趣的是，不同种属的菌落表现出不同的形态模式（图3a，b）。例如，Dorea、Bacteroides和Collinsella的菌落一般大而密集，但显示出不同的圆形（Collinsella > Bacteroides > Dorea），反映了它们生长特性的差异。另一方面，Faecalibacterium的菌落较小且较模糊，这与先前关于它们的可培养性较差的结果一致。此外，菌落形态根据它们的系统发育而明显聚类（图3c）。例如，通过基于形态的排序，梭状芽孢杆菌的大多数属相互之间比较接近（图3c）。因此，菌落形态可能嵌入了大量的信息，可以与分类学的身份联系起来。

肠道微生物之间的细菌生长关联

细菌菌落可以通过物种间的相互作用来影响其邻居的生长，如争夺营养物质或交叉喂养必需的代谢物。以前的研究表明，相邻的细胞可以以可预测的方式对菌落的大小产生关键影响。由于CAMII可以连续跟踪菌落的动力学生长，我们系统地探测了琼脂平板上肠道分离物之间的共生关联。每天对粪便样本进行电镀和成像，随后在第6天分离出所有菌落，并用16S测序确定其分类群身份（图4a）。

图4. 通过菌落形态学分析绘制肠道微生物群之间的相互作用图

对于每个ASV，琼脂平板上的菌落累积面积与它们在原始粪便样品中的丰度相关，表明我们的体外条件通常促进了与肠道中相同程度的生长。有趣的是，属于Faecalibacterium属的菌落最初生长较慢，只有在附近有其他生长的菌落时才开始出现（图4b）。这一观察结果表明，Faecalibacterium属和其他物种之间可能存在共生或互生的相互作用。

肠道菌株的个体内和个体之间基因组多样性

绘制人体内肠道细菌的菌株级全基因组多样性图谱，对于了解肠道定植的动态以及每个人类宿主特有的细菌选择和适应的驱动因素非常重要。CAMII系统的一个关键优势是能够分离出大量的分离株并进行WGS，以帮助研究个人之间和个人内部的基因组变化。因此，我们从20人的微生物组生物库中选择了涵盖最独特和最普遍的ASV的分离株，并进行WGS，产生了1197个高质量的基因组草图。对基因组组装进行了进一步的分析，以确定分离物的准确物种水平分类。

图5. 肠道微生物组在个体内部和个体之间的菌株级基因组多样性

与以前的报告一致，同一个体内的大多数分离株的基因组变异非常少（即少于102个SNPs），而人与人之间的分离株则有103–105 个全基因组SNPs的差异（图5a）。有趣的是，观察到同一物种的一些系统发育不同的分离株（即超过104 个SNPs）在同一个人体内共存（图5a）。例如，从H4个体中分离出两株不同的P. vulgatus，在H2个体中发现两株不同的B. uniformis。

人体内肠道微生物组进化的另一个主要驱动因素是水平基因转移（HGT）。因此，使用所有全基因组测序的H1分离株来重建一个长度大于2 kb的共享DNA元素的HGT网络。与最近的报告一致，我们观察到HGT事件与分离株的系统发育密切相关，也就是说，大多数HGT事件发生在同一门内，但也相当普遍地存在于不同的科和不同的物种之间（图5c）。有趣的是，我们观察到HGTs主要在具有相同革兰氏染色的分离株之间富集，革兰氏阴性物种比革兰氏阳性物种显示出更普遍的HGTs。这一结果与最近的发现一致，表明不同的细胞壁结构可能在HGTs中发挥重要作用。

总结

肠道微生物组的菌种分离历来都是以一种特别的方式进行的，其中重要的表型特征没有得到充分的捕捉，而且与基因组数据一起记录的很少。在这里，描述了CAMII平台，通过利用自动化、机器视觉、监督学习和基因组学，使分离生物库的生成工业化。当与低成本的16S和全基因组测序相结合时，从该管道产生的系统性的表型和基因组数据形成了丰富的资源来研究微生物菌落的形态、多样性和进化。以肠道微生物组为例，由CAMII支持的分离产生了来自20个健康人的广泛的分离生物库，按丰度计算，总共涵盖了所有微生物群的80%以上。这一分离株集涵盖了健康肠道中的大部分微生物多样性，是迄今为止描述的最广泛的个性化分离株生物库之一。利用这一资源，证明了对菌落形态的定量分析可以预测分类学，加强对目标菌属的分离，并揭示微生物之间潜在的相互作用。对人体内和人与人之间的分离物的基因组差异的系统分析揭示了有趣的种群选择、适应和HGT模式。

参考文献：

Huang, Y., Sheth, R.U., Zhao, S. et al. High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01674-2

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