dna提取试剂盒有哪些厂家,土壤DNA提取解决方案
土壤中的微生物资源非常丰富,原核生物细胞含量大约1×10^7个/g,但用传统技术培养的微生物仅占微生物总数的0.01%~10%,且大部分微生物处于不可培养的状态,使相当多的菌种不能被充分地开发和利用。
由于土壤微生物成分复杂,常规提取总DNA的方法难以去除腐殖酸,而微量的腐殖酸便可抑制PCR扩增中的TaqDNA聚合酶以及酶切反应的限制性内切酶活性。另外,土壤质地和成分的差异也会影响土壤微生物DNA的提取效果.
土壤DNA提取的一般方法学浅析
国内外学者对不同的土壤DNA提取和纯化方法进行了比较研究,现行土壤微生物基因组DNA提取方法可分为直接法和间接法2类,直接法采用原位裂解土壤微生物提取DNA(一般采用直接法),间接法采用速差离心回收菌体,裂解菌体提取DNA.间接法会大大降低土壤中腐殖酸,重金属盐对DNA提取带来的影响,但是这种方法会丢失许多微生物,得到的DNA并非土壤样品中的全基因组(宏基因组),目前已经很少研究者会采用这种方法,所以以下将围绕直接法进行展开。
SDS的高盐提取法
取lg上壤,枷入2·7mLDNA提取液,2卑L蛋白酶K225r/min、37振荡30min,加入0.3mL20%SDS,65度水浴(每隔15~20min轻轻颠倒几下),离心取沉淀加入0.9mLDNA提取液和0.1mL20%SDS,涡旋10s,65度水浴10min,离心收集上清,重复上述操作两次,合并上清,酚氯仿抽提,乙醇沉淀,用100μL无菌水溶解,
Eichner调整法:取lg上壤,加入lmLPBS、0.5mL溶菌酶、20μL蛋白酶K。37度水浴2h,加溶液Ⅰ(5mol/LNaCl,10%CTAB) 100μL,65度水浴10min,离心去沉淀,酚氯仿抽提,乙醇沉淀,用100μL用100μL无菌水溶解。
Kuske修订法
取1g上壤,加入2mL TENS混合,70度水浴1h,每隔15~20min轻轻颠倒几下,离心留上清,沉淀用1.5mL TEN洗一次,离心取沉淀加1.5mL TEN,混匀,混匀,反复冻融3次,离心取上清,酚氯仿抽提,乙醇沉淀,用无菌水溶解.
Edgcomb改进法
取lg上壤,加入2mL PBS,225r/min、37度振荡30min,离心取沉淀加入l.5mL溶液Ⅰ(0.15mol/LNaCl,0.1mol/L EDTA)、0.5mL 溶菌酶,37度水浴1.5h,加入5mol/L NaCI 270μL、溶于0.7mol/LNaCl的5mol/LCTAB270μL,水浴后加入2mL溶液Ⅱ(0.1mol/L NaCl,0.5mol/L Tris,10%SDS), 65度水浴10min,反复冻融3次,离心取上清,酚氯仿抽提,乙醇沉淀,用100μL无菌水溶解.
Tsai报道的方法
取lg上加入2mL PBS,225r/min,37度振荡3min,离心取沉淀加入l.5mL溶液Ⅰ(0.15mol/L NaCl,0.1mol/L EDTA)、0.5mL溶菌酶,37度水浴2h后加入2mL正溶液II(0.15mol/L NaCl,0.5mol/L EDTA,10%SDS)反复冻融3次,离心取上清,酚氯仿抽提,乙醇沉淀,用无菌水溶解.
高压灭菌法
取lg土壤,加lmL TE(l(10mM Tris.lmM EDTA、pH8.0),密封于灭菌的离心管中,离心管放入高压灭菌锅中灭菌,灭菌条件为:121度、1min,然后快速放气降压,离心取上清,酚氯仿抽提,乙醇沉淀,用100μL无菌水溶解.
综上,通过实际操作发现,以上几种土壤DNA提取方法普遍存在DNA得率低,或者DNA得率难于控制等问题。土壤样品或因肥沃,或因贫瘠,或因含水量丰富,或因干枯,或因取样的深浅度,都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。在一个小范围的土壤样品DNA含量往往会差别成千上百倍。此外,某些土壤中含有的化学成分,如重金属盐,粘土物质都会造成DNA得率降低。
鉴于以上问题,MP BIO公司开发出Fast DNA™ Spin Kit for Soil试剂盒,为目前土壤DNA快速高效提取提供了一种新选择。
土壤DNA快速高效提取方法
MP BIO Fast土壤DNA快速提取
Fast DNA™ Spin Kit for Soil 可以在 30 分钟内快速有效地从土壤等环境样本中直接提 取基因组 DNA。配合 MP FastPrep 仪器使用,可在 40 秒内破碎动植物组织,细菌,藻类, 真菌孢子,以及土壤等环境样本中的其它组成。
Fast土壤DNA快速提取操作步骤:
1. 在裂解介质管 E 中最多加入 500mg 土壤样品;
(注意:推荐最多加入 500mg 土壤样品,含水量比较多的土壤或者碎屑多的土壤可适量减少样品量。)
2. 在裂解介质管 E 中加入 978μl Sodium Phosphate Buffer;
3. 加入 122μl MT Buffer;
(注意:为了得到更好的样品处理效果,加入土壤样品及两个缓冲液后,在裂解介质管中 仍能保留有 250-500μl 空间。)
发生的反应:用洗涤剂溶解细胞膜蛋白以及细胞外蛋白和土壤中的污染物。
4. 将样品置于 FastPrep® 仪器上匀浆 40s,速度为 6.0m/s;
发生的反应:机械破碎土壤微生物的细胞壁,将核酸释放入保护缓冲液中。
5. 14,000 x g 离心 5-10min 至沉渣;
注意:如果把离心时间延长到 15min,可以更好地使样品量较大的,或者细胞壁结构较 复杂的细胞碎片沉降到管底 。
6. 将上清液转移至一个干净的 2.0ml 离心管中。加入 250μL 的 PPS 溶液(蛋白质沉淀溶 液),用手颠倒 10 次,使之充分混合;发生的反应:将溶解的核酸与细胞沉渣以及裂解介质分离。产生絮状蛋白。
7. 14,000 x g 离心 5min 至沉淀。将上清液转移至一个干净的 15ml 管中。注意:此步也可使用 2.0ml 离心管,但使用大管可以更好的混匀以及 DNA 的结合;
发生的反应:去除絮状蛋白。
8. 重悬 Binding Matrix 溶液,将 1.0 ml 重悬液加入该 15ml 管中;
9. 用摇床或手动颠倒混匀 2min,使 DNA 更好的与 Binding Matrix 结合。之后将管子置于 管架上,静置 3min,使 Binding Matrix 自然沉降;
发生的反应:在离液盐存在的情况下,核酸与 Binding Matrix 结合。
10. 小心地去除 500μl 上清液,避免吸到沉淀下来的 Binding Matrix;
11. 用剩余的上清液轻轻的重悬 binding matrix,转移大约 600μl 的重悬液至 SPIN™ Filter 中,14,000 x g 离心 1min,弃去收集管中的废液。将 15ml 管中剩余的重悬液转移到 SPIN™ Filter 中,再次离心弃去废液;
12. 加入 500μl 预先准备好的 SEWS-M 溶液,用枪头轻轻吹打,小心地重悬沉淀;
注意:使用前确保 SEWS-M 溶液中已加入乙醇。在 SEWS-M 溶液中加入 100ml 100% 的乙醇,混匀。在瓶子上做好标记,密闭储存于室温。
发生的反应:继续溶解蛋白。
13. 14,000 x g 离心 1min,弃去废液;
发生的反应:通过离心过滤,用脱盐的乙醇和去垢剂去除杂质,而 DNA 仍然与 Binding Matrix 结合。
14. 不加任何溶液,将 SPIN™ Filter 14,000 x g 离心 2min,去除残留的 SEWS-M 溶液。弃去收集管,更换一个新的、干净的离心管;
15. 将 SPIN™ Filter 置于室温,晾干 5min;
发生的反应:去除残留的乙醇。
16. 在 SPIN™ Filter 中加入 50-100μl 的 DES 溶液(或者无菌/无 DNA 酶的水),轻轻的 重悬 Binding Matrix。注意:a:为了避免过度稀释纯化出的 DNA,请尽量减少 DES 溶液的量 b:55˚C 水浴孵育 5min 能提高纯化产物的得率 ;
发生的反应:低盐洗脱液使 Binding Matrix 和 DNA 再水合化,导致盐桥断裂,从而使 纯化的核酸从 binding matrix 中洗脱下来。
17. 14,000 x g 离心 1min,使洗脱的 DNA 转移至收集管中。弃去 SPIN™ Filter。得到的 DNA 纯化产物可直接用于 PCR 及其它下游实验。使用前可储存于 4℃,长期保存可置 于-20℃;
发生的反应:最后纯化的 DNA 可通过过滤柱,收集至一个新的离心管中。
MP BIO 土壤DNA提取试剂盒方法学评估
货号 | 描述 | 包装 |
---|---|---|
116560200 | FAST土壤DNA提取试剂盒(离心柱式) | 50次 |
116560600 | FAST50mL土壤DNA提取试剂盒 | 10次 |
货号 | 描述 | 包装 |
---|---|---|
116560200 | FAST土壤DNA提取试剂盒(离心柱式) | 50次 |
116560600 | FAST50mL土壤DNA提取试剂盒 | 10次 |
货号 | 描述 | 包装 |
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116560200 | FAST土壤DNA提取试剂盒(离心柱式) | 50次 |
116560600 | FAST50mL土壤DNA提取试剂盒 | 10次 |
方案优势:
❖ 瞬间完全裂解环境生物学样品中的任何微生物;
❖ 获得的DNA直接用于定性或定量分析;
❖ 去除腐殖酸和PCR抑制剂,方便微生物多样性研究;
❖ 不同实验之间优异的重复性。
应用前景:
➢ 微生态学;➢ 海洋生物资源开发;宏基因组工程与海洋生物学进行有机的结合,促使人类了解许多为培养海洋微生物的基因组序列及其功能产物,在海洋天然药物研究、海洋极端环境微生物研究、海洋微生物多样性探索中具有十分重要的应用前景;➢ 环境保护和污染修复;➢ 生物酶制剂开发。
参考文献:
[1]EicherC A,Erb R W,TimmisKN,et al。Appl Environ Microbial [J].1996,620(10):3787-3793;
[2]Christense B,Fink J.Merrifield R B,et al.Proc Natl Acad USA[J].1998,85(14):5072-5076。
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