测序比对的方法—

此处仅记录用法，详细步骤查看官方文件：https://github.com/BenLangmead/bowtie/blob/master/MANUAL
bowtie简介

[Bowtie] is an ultrafast, memory-efficient short read aligner geared
toward quickly aligning large sets of short DNA sequences (reads) to
large genomes. It aligns 35-base-pair reads to the human genome at a
rate of 25 million reads per hour on a typical workstation. Bowtie
indexes the genome with a [Burrows-Wheeler] index to keep its memory
footprint small: for the human genome, the index is typically about
2.2 GB (for unpaired alignment) or 2.9 GB (for paired-end alignment).
Multiple processors can be used simultaneously to achieve
greater alignment speed.  Bowtie can also output alignments in the
standard [SAM] format, allowing Bowtie to interoperate with other tools
supporting SAM, including the [SAMtools] consensus, SNP, and indel
callers.  Bowtie runs on the command line under Windows, Mac OS X,
Linux, and Solaris.

1.建立索引

bowtie-build GRCh38.primary_assembly.genome.fa human1

得到文件如下：

-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 808M Jun 27 16:06 human1.1.ebwt
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 352M Jun 27 16:06 human1.2.ebwt
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh  12K Jun 27 14:56 human1.3.ebwt
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 704M Jun 27 14:56 human1.4.ebwt
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 808M Jun 27 17:15 human1.rev.1.ebwt
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 352M Jun 27 17:15 human1.rev.2.ebwt

2.进行比对
官网实例

bowtie [options]* -x <ebwt> {-1 <m1> -2 <m2> | --12 <r> | <s>} [<hit>]

单端

for i in {Ribo-KO-21,Ribo-KO-24,Ribo-WT-20,Ribo-WT-23}
do
bowtie /data/med-zhouh/index/bowtie_human_h38_index/human1 -m 1 -v 2 --best --strata  -q /scratch/2022-07-27/med-zhouh/ADAR_PARCLIP_RIBOSEQ/Reads/bowtie/rmrRNA/${i}.rmrRNA.fq  -S ${i}.sam
done

双端

bowtie /data/med-zhouh/index/bowtie_human_h38_index/human1 -m 1 -v 2 --best --strata  -1 /scratch/2022-07-27/med-zhouh/ADAR_PARCLIP_RIBOSEQ/Reads/bowtie/rmrRNA/${i}.rmrRNA.fq  -2 /scratch/2022-07-27/med-zhouh/ADAR_PARCLIP_RIBOSEQ/Reads/bowtie/rmrRNA/${i}.rmrRNA.fq -S ${i}.sam

不能是压缩包的形式。
参数

-f 指定query文件为fasta格式
-a 保留所有比对结果
-m 指定最大比对到基因组的次数
-v 允许最大错配数，为[0-2]
--al 能map到GENOME的reads，fasta格式
--un 不能map到GENOME的reads，fasta格式
--norc 不输出匹配到负链的结果；如果不想输出比对到正链的结果，则用"--nofw"。不指定该选项则正负链结果都输出
后面依次写上GENOME索引文件，Reads文件，输出结果文件Reads.bwt，日志文件log。
--best、--strata参考 https://www.plob.org/article/932.html

得到结果如下：

(riboseq) [med-zhouh@login01 bowtie]$ head B12-1_FRAS220043011-1r.sam
@HD     VN:1.0  SO:unsorted
@SQ     SN:chr1 LN:248956422
@SQ     SN:chr2 LN:242193529
@SQ     SN:chr3 LN:198295559
@SQ     SN:chr4 LN:190214555
@SQ     SN:chr5 LN:181538259
@SQ     SN:chr6 LN:170805979
@SQ     SN:chr7 LN:159345973
@SQ     SN:chr8 LN:145138636
@SQ     SN:chr9 LN:138394717

HD：VN表示版本，SO表示排序方式。

SQ：SN表示参考序列的名称，LN表示参考序列的长度

PG：比对时使用的工具指令。

3.把sam文件转化成bam
此处使用工具samtool，官网在这里，详细的资料看官网的具体描述，此处仅为脚本实例记录。
https://github.com/samtools/samtools/tree/develop/examples

samtools view -S ${i}.sam -b > ${i}.bam
####bam文件排序成sort.bam##
samtools sort ${i}.bam -n -o ${i}_sorted.bam
###Sort.bam建立index文件##samtools index ${i}_sorted.bam
####sort.bam进行比对得到bai和stat##samtools flagstat ${i}_sorted.bam > ${i}.stat
####去除PCR重复并建立索引##
samtools markdup -r ${i}.bam ${i}.rmdup.bam
###再重复一个index##
samtools index ${i}.rmdup.bam
###继续比对一下##
samtools flagstat ${i}.rmdup.bam > ${i}.rmdup.stat

bam文件结果如下:

(riboseq) [med-zhouh@login01 bowtie]$ samtools view -h B12-1_FRAS220043011-1r_sorted.bam | head
@HD     VN:1.0  SO:queryname
@SQ     SN:chr1 LN:248956422
@SQ     SN:chr2 LN:242193529
@SQ     SN:chr3 LN:198295559
@SQ     SN:chr4 LN:190214555
@SQ     SN:chr5 LN:181538259
@SQ     SN:chr6 LN:170805979
@SQ     SN:chr7 LN:159345973
@SQ     SN:chr8 LN:145138636
@SQ     SN:chr9 LN:138394717

3.2查看生成的bam文件的质量

cat *stat | grep %

得到结果如下：

6027738 + 0 mapped (15.74% : N/A)
6027738 + 0 properly paired (15.74% : N/A)
0 + 0 singletons (0.00% : N/A)
0 + 0 mapped (0.00% : N/A)
0 + 0 properly paired (0.00% : N/A)
0 + 0 singletons (0.00% : N/A)

特别差！！！！所以这个方法不合适，比较好的情况在80-90左右。

4.提取相应的counts

featureCounts -T 20 -p -a /data/med-zhouh/index/bowtie2_human_h38_index/gencode.v40.annotation.gtf  -o counts.txt ${i}.rmdup.bam

完成！

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