【BMC Plant Biol】MYB转录因子基因HtMYB2调控菊芋花青素生物合成

文章信息

题目：Functional MYB transcription factor gene HtMYB2 is associated with anthocyanin biosynthesis in Helianthus tuberosus L

刊名：BMC Plant Biology

作者：Jieming Gao, Baolong Liu et al.

单位：Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences

日期：01 June 2020‍

摘要

块茎颜色是菊芋（Helianthus tuberosus L.）的一个重要特征。通常，花青素含量高的紫色块茎比白色块茎更有营养。但是，其背后的分子机制尚不清楚。与栽培种QY3的白皮块茎相比，花青素生物合成结构基因在栽培种QY1红皮块茎中的表达量更大，表明'QY1'的花青素合成途径被激活。HtMYB2 (Unigene44371_All) 是唯一的 MYB 转录因子，与调节花青素生物合成的 MYB 转录因子同源，在“QY1”的红色块茎表皮中高表达。'QY1'的根、茎、叶、花和块茎表皮中的花青素浓度高于'QY3'，尤其是块茎表皮。相应地，'QY1'中的HtMYB2 在这些组织中的表达高于在 'QY3' 中。HtMYB2的表达与不同组织中花青素的积累有关。HtMYB2的过表达激活了花青素生物合成途径，在转基因烟草叶片中积累了色素，支持了HtMYB2调控花青素生物合成的模型。进一步的实验发现，HtMYB2在'QY1'和'QY3'中具有相同的编码序列和基因组序列，但在两个等位基因之间的启动子区域存在几个单核苷酸多态性和一个21个核苷酸的插入 - 缺失（indel）突变。三个核苷酸“AAA”的缺失使得“QY1”的启动子预测包含一个可能的启动子区域。基于插入缺失的特定引物可以区分具有红色或白色块茎表皮的品种。HtMYB2的遗传变异与自然种群中的块茎颜色有关。通过RNA-seq可以成功分离出控制菊芋块茎紫色表皮中花青素生物合成的候选基因（HTMYB2 ）。HTMYB2可调控植物花青素的生物合成，与块茎紫色表型的形成密切相关。这项研究应该有助于了解不同块茎皮肤颜色的遗传机制，以及培育具有不同块茎皮肤颜色的新菊芋品种。

技术路线

主要结果

3.1 两种菊芋品种的转录组分析

对来自 QY1 和 QY3 块茎表皮的 RNA 进行测序（图 1a）。过滤后，从两个品种的三个样品中获得总共 50 Gb 的Clean数据。使用 Trinity 软件，组装了 197,769 个 unigenes。共有55,354个unigenes差异表达，其中28,113个unigenes上调，27,241个unigenes下调（图1b）。选择鉴定为与参与花青素合成的基因同源的unigenes，并汇总每个栽培品种的FPKM值。没有一个花青素生物合成结构基因在'QY1'中的表达水平低于'QY3'（图1 c)、关键结构基因CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR和ANS的转录水平在'QY1'中高于'QY3'。相对于'QY3'，'QY1'中结构基因的上调倍数分别达到3.98、0.18、5.49、2.91、3.33、6.71和0.25（表S 2）。qPCR结果也证实了这些发现（图1d）。与'QY1'中结构基因表达的上调一样，编码转录因子MYB和bHLH的基因在'QY1'中表现出比在'QY3'中更高的表达水平（表S 2）。考虑到结构基因受转录因子调控，MYB转录因子可诱导bHLH转录因子表达。HtMYB2(Unigene44371_All)应该是H. tuberosus红色块茎皮肤颜色性状的关键基因。

3.2 HtMYB2的分子特征

基于转录组信息，从'QY1'和'QY3'中分离出HtMYB2的全长和编码序列（CDS）。来自'QY1'和'QY3'的HtMYB2基因组序列分别包含1066 bp和1068 bp，而编码序列的长度相同。HtMYB2包含三个内含子和两个外显子（图 2a ）。虽然'QY1'和'QY3'的CDS的第三个外显子存在两个核苷酸差异，但在翻译序列中仅发现一个氨基酸差异（图2 ）C）。MYB转录因子的系统发育树表明，HtMYB2与控制同一物种中花青素生物合成相关性状的MYB转录因子相似，包括菊科、茄科和十字花科的成员（图2b）。与最相似的MYB转录因子CmMYB6、GbMYB1、GbMYB2a、GhMYB10和HaMYB90相比，HtMYB2含有完整的 MYB 样结合域（图2c)，这对于发挥MYB转录因子在调节花青素生物合成中的作用很重要。这意味着HtMYB2应该具有调节花青素生物合成的功能。

3.3 HtMYB2的过表达诱导烟草中花青素的生物合成

将pJAM1502:HtMYB2质粒转移到根癌农杆菌菌株LBA4404中。进行农杆菌介导的叶盘转化法以获得转基因烟草。对于进一步的实验，使用携带目标基因的T3家族系没有分离。阳性转基因株系叶片呈深紫色（图 3a），转基因株系的花青素相对浓度远高于野生型（图3b）。qPCR实验表明，转基因株系中花青素合成相关结构基因和HtMYB2的表达水平上调（图3 C）。这些结果表明，HtMYB2可以通过作为烟草中的MYB转录因子来激活花青素的生物合成。

3.4 HtMYB2转录本丰度与不同组织中花青素浓度的关系

从视觉上看，'QY1'的根和块茎表皮明显比'QY3'的那些层更红，而两个品种的茎、叶和花之间的表型差异很小（图4a ）。相应地，'QY1'块茎皮和根的花青素浓度显着高于'QY3'，而两个品种的茎、叶或花的花青素浓度无显着差异（图4b）。HtMYB2的表达与花青素浓度一致。HtMYB2表达最高的组织是'QY1'的块茎表皮，其次是'QY1'的根部（图4 b)，而'QY1'的其他组织和'QY3'的所有组织几乎没有HtMYB2的表达。

3.4 菊芋自然种群中HtMYB2的等位变异

HtMYB2在'QY1' 和'QY3' 之间的块茎表皮中表现出明显的表达水平差异。使用 TAIL-PCR 从每个品种的HtMYB2中分离出启动子，以解释两个品种之间HtMYB2表达的差异。基于启动子预测软件 BDPG，来自“QY1”的启动子具有三个可能的启动子区域，而“QY3”仅包含两个（表 S 3）。'QY1'中三个核苷酸“AAA”的缺失导致两个品种的启动子存在差异。

与 QY3 的启动子相比，QY1 启动子的 - 1360 至 - 1342 区域缺失了 21 bp（图 5a）。基于两个启动子之间的插入缺失差异，引物 HtproS 旨在区分HtMYB2与“QY1”和“QY3”。'QY1' 的扩增片段长度为 103 bp，而'QY3' 扩增片段的长度为 124 bp（图5a）。该引物对可以有效区分HtMYB2 -QY1和HtMYB2 -QY3（图S 1）。在180个选定的个体植物中，90个红皮块茎个体携带基因型HtMY23 -QY1，而90个白皮块茎个体携带基因型HtMYB2 -QY3（图5b）（表 S 4）。结果表明，HtMYB2的等位基因变异与H. tuberosus的块茎皮肤颜色一致。

结论

在本研究中，HtMYB2通过 RNA-seq从H. tuberosus中分离出来。它与其他已被证明可调节其他植物花青素生物合成的 MYB 转录因子具有相同的内含子和外显子数以及相同的功能域。HtMYB2在系统发育树中与此类功能性 MYB 转录因子很接近。HtMYB2的过表达诱导烟草中花青素的生物合成。虽然HtMYB2在红皮块茎QY1和白皮块茎QY3中具有相似的编码序列，但'QY1'块茎表皮中HtMYB2的转录本丰度显着高于'QY3'。HtMYB2仅在'QY1'的根和块茎表皮中检测到转录物。启动子差异与“QY1”和“QY3”之间 HtMYB2转录本丰度的差异有关。HtMYB2基因的等位变异与自然种群中的块茎颜色密切相关。上述结果表明，HtMYB2是一种功能性MYB转录因子，调节菊芋花青素的生物合成，在决定菊芋表皮性状中起重要作用，为培育具有不同块茎颜色的菊芋新品种提供了参考。

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原文链接：

https://bmcplantbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12870-020-02463-8#Sec2

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