题目：Genetic disruption of Arabidopsis secondary metabolite synthesis leads to microbiome-mediated modulation of nematode invasion.

杂志：ISME J

日期：2022.06.27

影响因子：11.217

DOI：https://doi.org/10.1038/s41396-022-01276-x

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背景

线虫是地球上最丰富的后生动物，其中植物寄生线虫（PPNs）在全世界造成超过10%的产量损失。植物和PPNs的互作依赖复杂的化学信号，植物可以释放一些代谢物如硫代葡萄糖苷、植保素（camalexins）和黄酮类化合物到根际吸引或排斥线虫，或影响线虫发育、繁殖及生存。植物次生代谢物也影响微生物，例如外源硫代葡萄糖苷发生改变的转基因拟南芥株系CYP79A1，其根和根际相关微生物群落也发生了显著变化。硫代葡萄糖苷和植保素降低的拟南芥根结线虫根瘿数量更高。

黄酮类化合物在植物根发育、色素沉积、紫外保护、吸引传粉者、根瘤菌和豆类共生以及与根微生物互作等方面都有重要作用。此外它还参与植物对PNNs的防御反应，如在大豆和苦楝中防御根结线虫、在大豆中防御包囊线虫、在香蕉中防御香蕉穿孔线虫、在白花苜蓿中防御鳞球茎茎线虫。体外实验也表明它对根结线虫和包囊线虫有毒杀作用。此外，它还影响根际细菌和真菌的生长速率。

先前研究大多是基于单种线虫、体外或合成培养基等条件下进行的。而在自然土中，要阐明微生物组介导的植物-线虫互作机制，同时需要体内和体外实验。同时，关于植物代谢物对线虫群体的影响的研究依然缺乏。根微生物可以调控根-代谢物-线虫之间复杂互作，因此在植物-线虫互作的研究中把微生物组考虑进来是非常必要的。

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研究内容

硫代葡萄糖苷、植保素（camalexins）和黄酮类化合物发生变化的拟南芥突变体在耕作土壤中根相关线虫和微生物群落。分析了线虫和微生物群落的共现模式，并在根结线虫（Meloidogyne incognita）的自然宿主番茄上测试了从拟南芥突变体中分离出来的微生物组对M. incognita入侵的影响。

所测扩增子区域

线虫：18S rRNA基因的V6-V8区

真菌：ITS2区

细菌：16S rRNA基因的V3-V4区

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摘要

深入研究代谢物介导的植物-线虫互作可以引导我们探索新的线虫管理策略。为提升我们对次级代谢物对土壤线虫群落影响的理解，我们种植了硫代葡萄糖苷、植保素和黄酮类化合物合成通路发生遗传改变的拟南芥，并利用元条形码（metabarcoding）技术分析了它们根相关的线虫群落。为测试相关微生物群落对线虫应答的调控效应，我们还对细菌和真菌群落进行了表征。最终，作为微生物组操控线虫入侵效果的媒介，我们从突变体分离了根相关微生物组并测试了它们对于植物寄生根结线虫Meloidogyne incognita穿透番茄根能力的影响。大部分突变体拥有一些相对丰度改变的线虫类群，对北方根结线虫（Meloidogyne hapla）的影响比对其它根食线虫的影响大。这可能反映了M. hapla入侵并留在根内，因此与宿主有亲密关联。当转移到番茄时，来自黄酮类化合物产生过量突变体pap1-D的微生物组增加了M. incognita的根入侵，而来自黄酮类合成不足突变体的微生物组则降低了M. incognita的根入侵。这表明微生物组介导的黄酮类化合物对Meloidogyne感染性的影响可能是通过改变所转移的微生物组中特定微生物类群的丰度实现的，尽管我们不能最终确定这些类群。

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结果

干扰硫代葡萄糖苷、植保素和黄酮类化合物合成通路影响了线虫群落

根相关线虫群落：PCoA图表明，硫代葡萄糖苷突变体几乎都与Col-0分开（myb51除外，作者讨论中说可能是由于它对硫代葡萄糖苷比较弱的影响）；植保素突变体可以与Col-0分开；而黄酮类合成缺陷的突变体中tt3-1和tt3-1tt5-1可以与其亲本株系Ler-0分开，而过表达突变体pap1-D不能与Col-0分开（图1）。作者讨论说虽然pap1-D突变体可以积累更多黄酮类化合物、花青素、羟基肉桂酸、S-和G-木质素，单Col-0中已有足够的量，因此没有与Col-0分开。

图1 基于Bray-Curtis距离，拟南芥根相关线虫群落的PCoA图

次级代谢物特异性影响了PPN类群

突变体对线虫类群有各自的富集模式，黄酮类化合物过量合成的pap1-D突变体没有显著变化的线虫类群（图2）。根结线虫（Meloidogyne）在除了pap1-D的所有突变体中富集（图2），短体线虫属（Pratylenchus）和根外寄生针线虫属（Paratylenchus）在几乎所有的突变体中降低，而Bitylenchus在大部分硫代葡萄糖苷突变体而不是黄酮类突变体中富集（图2）。自由生活的线虫在突变体中有富集也有降低，如食细菌线虫Pseudoacrobeles在硫代葡萄糖苷和植保素突变体中富集而在黄酮类合成中断的突变体中减少（图2）。

图2 DESeq2方法分析得到的突变体相对于亲本株系差异富集的线虫类群，蓝色代表在突变体中富集。

与差异富集分析一致，相对丰度图也表明根结线虫在大多数突变体中增加，但是没有在pap1-D突变体中增加（图3a）。针对M.hapla的qPCR也从绝对丰度方面证明了它在五个硫代葡萄糖苷突变体中丰度显著升高（图3b）。

图3 线虫群落组成情况以及qPCR验证结果。

次级代谢物影响微生物群落和微生物群落与土壤线虫的共现模式

PCoA图发现除了pap1-D株系外，硫代葡萄糖苷、植保素和黄酮类化合物突变体的微生物群落都可与Col-0/Ler-0分开（附图）。线虫和微生物组之间有正和负的相互作用。根结线虫（Meloidogyne）与细菌Rhizobium、Adhaeribacter、Deinococcus、Gemmatimonas、Iamia、Nocardioides、以及Oceanobacillus负相关；与Bacillus、Castellaniella、Gemmata、Haliangium、Leptolyngbya、Pirellula、Rhodopirellula和Taibaiella正相关（图4a）。真菌类群Acremonium、Dichotomopilus、Exophiala、Lachnum、Meliniomyces、Monocillium、Metapochonia、Pseudogymnoascus和 Trichoderma与一些线虫类群呈负相关，包括根结线虫（Meloidogyne）。真菌Clonostachys与线虫Filenchus和Pratylenchus负相关，真菌Mortierella与Bitylenchus和Acrobeles呈负相关。真菌Auxarthron、Paraphoma、Oidiodendron、Metarhizium与根结线虫正相关（图4b）。作者在讨论中提到了这些负相关的菌，其中有一些已报道具有拮抗线虫的功能，算是解释。

图4 通过计算Spearman相关系数得到的线虫和土壤细/真菌之间的相关性（p<0.01）

来自黄酮类化合物合成改变的根相关微生物组影响根结线虫（M. incognita）入侵番茄根的能力

来自黄酮类合成过量突变体pap1-D的微生物组可以增加根结线虫的入侵，而来自黄酮类合成缺陷突变体ttg1ttg2和tt3-1tt5-1的微生物组则降低根结线虫的入侵（图5）。（这里和前面的实验结果pap1-D没有显著影响线虫类群不一致，作者讨论说Col-0相较于pap1-D已有足够黄酮类化合物、花青素、羟基肉桂酸、S-和G-木质素来抵御线虫入侵，还轮不到微生物组的效应。而后面结果表明，过高的上述代谢物会降低杀线虫的微生物）注意，所用的微生物群落生物量是相似的（附图）。PCoA图表明pap1-D来源的细菌群落与其亲本株系不能分开，而ttg1ttg2和tt3-1tt5-1可以（附图）。对于真菌群落，黄酮类化合物合成突变株与其亲本株系不能分开（附图）。

DESeq2分析表明，pap1-D突变体没有显著影响大多数纲水平的细菌（附图）。然而在OTU水平的t-test发现，Chitinimonas在pap1-D中减少（Chitinimonas已知具有代谢甲壳素的能力，而甲壳素是线虫表皮和卵壳的主要成分），Halomonas、Chitinophagaceae、Terracidiphilus、Pseudogulbenkiania、Herminiimonas和Salinimicrobium则富集（附表）。类似的，DESeq2分析发现一些物种在tt3-1tt5-1中富集，其中一些也在黄酮类合成缺陷突变体ttg1ttg2中富集（附图）。

对于真菌群落，Cladosporium在pap1-D突变体中显著富集，而在tt3-1tt5-1突变体中显著降低，而Vishniacozyma在pap1-D中显著降低（附图）。成对t-test发现Gibellulopsis nigrescens、Keithomyces、Solicoccozymaterricola、Tetracladium、Clonostachys rosea、Mortierella、Acremonium和Acrostalagmus在pap1-D中显著降低，未观察到显著富集的真菌（附表）。大部分在pap1-D中降低的菌在ttg1ttg2中也降低，而Fusicolla、Trichoderma、Chloridium、Pyrenochaetopsis和Monocillium griseo-ochraceum 在tt3-1tt5-1中降低（附表）。然而几乎没有在此突变体中富集的菌（附表）。

图5 拟南芥根相关微生物群落对根结线虫入侵番茄根的影响。

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通讯作者

Mogens Nicolaisen，丹麦奥胡斯大学植物病理学教授。主要研究方向：微生物群落及其与植物的互作，研究植物健康如何被叶际、根际和土壤微生物组影响。主要借助于二代测序进行研究。此外还进行植物病原菌诊断、检测和监测的分子实验的开发。

H指数35，发表文章情况见https://scholar.google.dk/citations?user=FPhRF5wAAAAJ&hl=da

Reference:

Sikder, M.M., Vestergård, M., Kyndt, T. et al. Genetic disruption of Arabidopsis secondary metabolite synthesis leads to microbiome-mediated modulation of nematode invasion. ISME J (2022). https://doi.org/10.1038/s41396-022-01276-x

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