《NK细胞培养扩增解决方案》

自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）在人体的先天免疫系统中起着重要的作用，早在70年代，科研人员就对它们进行了描述，但直到最近的15年，人们才逐渐了解NK细胞在帮助抗击癌症和其它疾病方面的复杂性和治疗潜力。

2000年，科学家研究证实小鼠癌症的发生和NK细胞自身的缺陷有关。2013年，有研究对癌症患者采用NK细胞疗法，在随后的跟访中，可以确定NK细胞的活性越好，癌症治疗效果会更好，同时也会降低癌症复发风险。这项研究无论是在胃癌、神经母细胞瘤还是结直肠癌患者群体中，都有相同的观察结果。同时在另外一项关于60例NK细胞疗法干预恶性肿瘤的临床疗效评价中，对比NK细胞回输治疗前及治疗后1周患者的生存质量，结果发现整体生存质量评分增加，各功能维度评分增加，症状维度评分减低。

而在最新的研究中，NK细胞疗法被广泛用于各种癌症的治疗，包括：血液系统肿瘤、神经母细胞瘤、卵巢肿瘤、横纹肌肉瘤、乳腺癌、胃癌等等，均取得了不错的临床治疗效果。大量研究数据表明，NK细胞疗法在提高恶性肿瘤患者免疫功能和生存质量方面都有极为不错的表现，可以与手术、放疗和化疗等传统治疗方案互补，在未来可能成为治疗癌症患者的新手段。

NK细胞已在国内多项临床研究中显示良好效果

1.NK细胞治疗肝癌

方法：研究对象为暨南大学附属复大肿瘤医院2016年2月至2017年9月收治的17 例肝癌患者，采集患者本身或其亲属的外周血，体外培养诱导产生高活性 NK( HANK) 细胞，在第 14、15 和16天进行静脉输注，连续3次输注为1个疗程，每个患者接受至少1个疗程的治疗。分别于每疗程治疗前及疗程治疗结束后3 周取患者外周血检测淋巴细胞亚群，比较治疗前后淋巴细胞亚群的变化及其与短期临床疗效的关系。

结果：经 HANK 细胞治疗后，17例肝癌患者达到部分缓解( partial response，PR) 2 例，病情稳定( stable disease，SD) 8 例，疾病进展( progressive disease，PD)4例，失联3例；缓解率为14.3%，疾病控制率为71.4%；HANK 细胞治疗前后淋巴细胞亚群无明显变化。治疗过程中 17例患者并未发生不良反应。

结论:异体 NK 细胞免疫治疗可缓解病情且安全无副作用，在肝癌治疗中有潜在的应用价值。

2.NK细胞治疗晚期结肠癌

方法：收集 2015 年 6 月-2017 年10月杭州师范大学附属医院肿瘤内科Ⅳ期结肠癌患者37例，治疗方案经患者知情同意，共分为两组，单克隆靶向药联合化疗药物和体外培养NK细胞（A 组）17例，化疗联合单克隆靶向药物治疗20例（B组），均经病理证实为结肠腺癌。统计患者治疗疗效，分析治疗前后 PS评分、粒/淋（Neutrophil to Lymphocyte Ratio，NLR）比值、NK细胞水平改变，观察不良反应发生率，两组患者经过 3-12个月的随访，参照实体瘤评价标准1.1 版评估患者疾病控制率（Disease control rates，DCR）、中位疾病进展时间（Time To Progress，TTP）。

结果：A组 NK细胞数量及活性较B组明显上升，粒/淋比值水平显著下降（P=0.002）；A组DCR较B组改善明显（P=0.018）；功能状态评分（PS 评分）两组均有改善，A组较 B 组改善明显（P=0.024），疾病进展时间（TTP）显著延长（P=0.003）；输注过程中不良反应发热不适组间无明显差异性，A组 3、4 级骨髓抑制发生率较B组有显著改善（P=0.04）。

结论：化疗、单克隆靶向药物联合NK细胞治疗能够提高药物抗肿瘤杀伤性，改善结肠癌患者基础免疫状态，降低化疗及靶向药物毒副反应，一定程度上提高带瘤生存质量，延长生存期。

评价标准：（1）完全缓解（CR）（2）部分缓解（PR）（3）疾病进展（PD）（4）疾病稳定（SD）两组疗效评价

两组治疗前后结肠癌肝转移影像改变（PR）A组：NK细胞联合化疗、西妥昔单抗，B组：化疗联合西妥昔单抗

3.NK细胞治疗急性髓系白血病

方法：北京大学人民医院回顾性分析2014年1月至2019年6月诊治的23例经化疗达血液学完全缓解（CR），且巩固治疗3个疗程后，应用巩固化疗联合异基因NK细胞回输治疗的低中危AML患者，对照组为1∶2配对的46例AML患者，配对因素为患者的性别、年龄、诊断、预后危险分层、诱导CR及NK 细胞输注前巩固化疗的疗程数。比较两组微小残留病（MRD）转阴率、复发率、无白血病生存（LFS）及总生存（OS）。

结果：治疗组23例低中危AML患者于巩固化疗第4～7个疗程共输注NK细胞45次，中位NK细胞输注数量7.5（6.6～8.6）×109 /L，NK细胞中位存活率95.4％（93.9％～96.9％），中位扩增倍数141.1（86.1～171.1），其中中位CD3-CD56+细胞数5.0（1.4～6.4）×109 /L，占回输细胞总数的76.8％（30.8％～82.9％）；CD3+ CD56+ 细胞数0.55（0.24～1.74）×109 /L，占回输细胞总数的8.8％（4.9％～20.9％）。NK细胞输注前，治疗组 MRD阳性患者为 9 例（39.1％），对照组 MRD 阳性患者为19 例（41.3％），两组间差异无统计学意义（χ2＝0.030，P＝0.862）。治疗组输注NK细胞前后疗效评估与同期对照组对比，MRD阴性转阳性比例两组差异无统计学意义［14.3％（2/14）对22.2％（6/27），χ2＝0.037，P＝0.847］。治疗组MRD由阳性转为阴性的患者占66.7％（6/9），明显高于对照组的10.5％（2/19）（χ2＝6.811，P＝0.009）。其中治疗组有1例MRD阴性患者发生了形态学复发，对照组有2例MRD阳性患者形态学复发。截至末次随访，中位随访35（10～59）个月，治疗组与对照组MRD阴性患者比例差异无统计学意义［43.5％（10/23）对43.5％（20/46），χ2＝1.045，P＝0.307］。在形态学复发方面，虽然两组差异无统计学意义，但是治疗组形态学复发患者比例明显低于对照组［30.4％（7/23）对50.2％（24/46），χ2＝2.929，P＝0.087］。治疗组预计 3 年 LFS 率为（65.1±11.1）％，明显高于对照组的（50.0±7.4）％（P＝0.047）。治疗组、对照组的预计3年OS率分别为（78.1±10.2）％、（65.8±8.0）％（P＝0.212）。

治疗组和对照组患者无白血病生存（A）和总生存（B）比较

结论：巩固化疗联合异基因NK细胞输注可能有助于低中危AML患者达到更深层次的缓解，减少远期复发。

4.NK细胞治疗肺癌

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。肺癌发病率在许多国家和地区都有升高的趋势，在我国肺癌的发病率和死亡率曾经高居榜首。

方法：解放军第152中心医院肿瘤科，曾选取94例小细胞肺癌患者为研究对象，根据其入院顺序分成联合组（A 组n＝47）和对照组（B组，n＝47）两组，B组仅予以（依托泊苷＋顺铂）单纯化疗方案，A 组则采用NK细胞、CIK细胞及γ/δT细胞免疫联合化疗方案。行为期2-5年随访，比对两组患者总生存期及无进展生存期差异，记录其相关不良反应发生情况。

结果：①A、B两组的局限期患者在无进展生存期（PFS ）及1年生存率对比上差异无统计学意义（P＞0.05 ）；A组局限期患者总生存期（OS）及2年生存率优于B组（ P＜0.05）；A组广泛期患者在 PFS、OS、1年及2年生存率等指标对比上均明显优于B组（P＜0.05）；两组局限期患者PFS 及OS 均长于广泛期患者，差异有统计学意义（P＜0.05 ）；②两组患者不良反应发生率对比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：对小细胞肺癌患者予以细胞免疫治疗联合化疗方案，疗效突出，值得临床推广 。

国外NK细胞疗法研发如火如荼

1.CAR-NK结合死亡受体（DR5）TRAIL变体治疗B细胞恶性肿瘤

2020年5月，致力于开发独特的递送平台的爱尔兰细胞工程技术公司Avectas获得了ONK公司的CAR-NK细胞疗法的独家许可，这款CAR-NK结合了ONK专有的死亡受体（DR5）TRAIL变体，用于治疗B细胞恶性肿瘤。

两家公司的合作目标是开发同种异体、现货型CAR-NK。旨在结合Avectas专有的非病毒细胞工程平台Solupore®与ONK的DR5 TRAIL变体技术，优化设计，提高特定癌细胞的靶向性，并启动短暂的次级癌细胞杀伤机制来增强治疗效果和剂量控制。

2.异体NK细胞治疗新冠、血液瘤和实体瘤

2020年4月2日，致力于开发同种异体细胞疗法的Celularity公司宣布，CYNK-001治疗成年COVID-19患者的IND获得了FDA批准，并准备开展I/II期临床研究，纳入了多达86名COVID-19患者。

CYNK-001是一种冷冻保存的、同种异体的、“现货”的NK细胞疗法，来源于胎盘造血干细胞。其被开发用于各种血液肿瘤和实体瘤的潜在治疗方案，目前正在急性髓细胞性白血病（AML），多发性骨髓瘤（MM）和多形性胶质母细胞瘤（GBM）患者中进行临床试验。

5月21日， Kleo Pharmaceuticals和Celularity达成一项临床前研究合作，快速推进Kleo的全合成双特异性分子——抗体募集分子（ARM™）平台和Celularity的胎盘来源NK细胞的协同合作，开发COVID-19和多发性骨髓瘤的潜在治疗方法。今年2月，Kleo公司基于ARM™平台的靶向CD38的ARMs（KP1237）联合患者自身的NK细胞的策略已经获美国FDA批准临床试验，用于多发性骨髓瘤患者。

8月，Celularity公司获得了加州再生医学研究所（CIRM）75万美元的COVID-19项目资助。该资助款将支持加州的研究机构启动NK细胞疗法CYNK-001用于COVID-19成年患者的1/2期临床试验。

3.TriNKET免疫疗法候选药物晚期实体瘤

2020年7月，Dragonfly Therapeutics启动了DF6002针对晚期实体瘤的1/2期研究。该研究将对DF6002的安全性、耐受性、药代动力学生物学和临床活性展开研究，同时结合PD-1观察对局部晚期或转移性实体瘤患者的抑制作用，然后扩展所选适应症。

DF6002是一种单价IL-12免疫球蛋白Fc融合蛋白，能够通过建立生产性抗肿瘤反应所必需的炎性肿瘤微环境来实现强大的抗肿瘤功效。

8月18日，百时美施贵宝（BMS）宣布获得Dragonfly Therapeutics的IL-12研究性免疫疗法项目的独家授权，包括TriNKET免疫疗法候选药物——半衰期延长细胞因子DF6002。DF6002的授权是BMS从Dragonfly Therapeutics获得的第4个TriNKET免疫疗法候选药物的许可。

TriNKE（Tri-specific；NK cell Engagement Therapies/三特异性；自然杀伤细胞接合器疗法）平台的作用机制主要是通过提供癌细胞与免疫系统细胞（包括NK细胞本身、T细胞、B细胞和其他有助于攻击和杀死癌症的细胞）之间的主动连接进行运作，极大地提高了自然杀伤细胞—NK细胞的免疫能力。

12月1日，默沙东（MSD）从Dragonfly Therapeutics获得了首个TriNKET™免疫治疗候选药物的许可。

4.人类iPSC来源NK细胞治疗血液瘤和实体瘤

Fate Therapeutics是一家致力于开发NK细胞治疗用于癌症和免疫系统疾病细胞疗法的临床阶段生物公司，利用人类iPSC来开发NK细胞产品。这种“现成的”治疗方法，有望避免患者个性化治疗方法带来的限制。

FT516是一种工程化表达高亲和力不可裂解的CD16 （hnCD16）的现成NK细胞疗法，用于治疗急性髓系白血病和B细胞淋巴瘤；FT596的设计旨在克服CD19抗原逃逸，除了有靶向CD19的专有CAR以外，它还表达了一种新型的高亲和力、不可裂解的CD16 Fc受体，和白介素15受体融合蛋白(IL-15RF)，这是一种有效的细胞因子复合物，无需系统性细胞因子支持，即可促进NK；F538是CRISPR编辑的、iPSC衍生的现货型NK细胞疗法，其被工程化设计了三种功能成分来增强先天免疫：新型高亲和力不可裂解的CD16 Fc受体、IL-15RF、CD38表达的消除。

1月13日，Fate Therapeutics宣布FDA批准FT516联合PDL1-、EGFR-和HER2-靶向的治疗性单抗用于晚期实体瘤的IND申请。这是F516的第2项IND申请（第1项用于治疗血液瘤），同时这也是该公司专利iPSC产品平台获得的第4个IND。

4月2日，Fate Therapeutics宣布完成FT596在B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的临床研究的首例患者给药。2019年9月，美国FDA批准Fate公司FT596的IND申请。

5月20日，F538获美国FDA批准其IND申请，Ⅰ期临床将评估FT538作为单一疗法（多剂量）治疗AML，以及联合抗CD38单克隆抗体治疗多发性骨髓瘤。

5.K-NK通用型细胞疗法治疗肿瘤以及传染病

Kiadis Pharma是一家临床阶段的生物制药公司（股票代码：KDS），致力于开发创新的基于细胞的药物来治疗威胁生命的疾病。它与全国儿童医院的阿比盖尔·韦克斯纳研究所（AWRI）合作开发了Kiadis-NK细胞（K-NK细胞），作为COVID-19的暴露后抢先治疗疗法。

2020年9月14日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了AWRI的一项研究性新药（IND）申请，针对使用Kiadis专有的Universal Donor和PM21技术生产的现成的自然杀伤（NK）细胞用于成年人群的研究。

11月2日，赛诺菲宣布以3.08亿欧元（3.58亿美元）收购临床阶段生物制药公司Kiadis。此次收购将使赛诺菲获得了Kiadis的现货型NK细胞平台“K-NK”，开发用于治疗造血干细胞移植、液体和实体瘤以及传染病的NK细胞疗法。与CAR-NK细胞疗法相比，K-NK细胞疗法的优势是没有经过复杂的工程化改造，因此生产成本更低，可冻存备用，并可以与多种不同靶点的抗体药物联用。

6.NK细胞疗法联合PD-L1抑制剂和IL-15激动剂转移性胰腺癌、默克尔细胞癌

1 月初，NantKwest公司在第38届JP Morgan医疗健康大会上，报告了其另一款候选疗法PD-L1.t-haNK联合N-803疗法在转移性胰腺癌的试验数据，在该实验中，前10名患者达到部分缓解，1名患者在接受PD-L1.t-haNK和N-803的5次输注之后，根据CT/Pet扫描患者的肿瘤转移已完全消退，并且已通过重复的CT/Pet扫描确认了完全缓解。

3月19日，NantKwest宣布了在二线和三线治疗默克尔细胞癌（MCC）的2期临床试验中（NCT03853317），首名MCC患者接受靶向CD16的haNK、辉瑞公司的PD-L1抑制剂avelumab、ImmunityBio的新型IL-15超级激动剂复合物N-803联合疗法。

PD-L1.t-haNK和haNK都是经过工程改造以表达高亲和力CD16受体的NK细胞，起源于NantKwest专有的NK-92(aNK)主细胞库。PD-L1.t-haNK还表达靶向PD-L1的CAR。两款NK通过直接结合先前与癌细胞结合的单克隆抗体，以介导的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）作用来增强对肿瘤细胞的杀伤作用。

7.工程化NK细胞疗法治疗急性白血病

2020年7月，致力于开发治疗癌症的工程化NK细胞疗法的临床阶段生物制药公司Nkarta Therapeutics登陆纳斯达克。其主要候选产品NKX101用于治疗复发/难治性急性髓系白血病（r/r AML）或高风险骨髓增生异常综合症（MDS）的IND申请也在当月获FDA批准。随着其IND计划的进行，Nkarta还将把NKX101扩展至实体肿瘤，他们将测试局部递送的方式在抑制肝脏相关局部转移中的效用。

NKX101的CAR被设计用来靶向NKG2D。与T细胞中编程的嵌合抗原受体不同的是，该靶点在肿瘤细胞上最多可找到的8种相关配体。与临床前模型中的非工程NK细胞相比，NKX101的NKG2D表达量增加了10倍，细胞毒活性增加了4倍。此外，Nkarta公司通过基因工程的方法，使外周血NK细胞表达膜结合的IL15（mbIL15），提高了NK细胞的存活、增殖和杀伤能力。

11月9日，Nkarta公司在2020年第35届癌症免疫治疗学会（SITC）年会上，以学术海报的形式公布了该公司另一个免疫疗法候选药物NKX019治疗B细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病的最新临床前数据，结果支持了NKX019的效力、安全性和耐受性特征。另外，该公司预计将在2021年第1季度递交NKX019的IND申请。11月12日，Nkarta宣布，其主要候选产品NKX101用于r/r AML或高风险MDS的首次人体试验（first-in-human）已完成首例患者给药。

NK细胞的学术研究新进展

1.淋巴瘤新策略——双重功能化的NK细胞

12月7日，美国Scripps研究所的科学家在Angewandte Chemie杂志上发表了一篇Glycoengineering of NK Cells with Glycan Ligands of CD22 and Selectins for B‐Cell Lymphoma Therapy的论文，证明了一种治疗淋巴瘤有前景的新疗法。新方法使用天然的癌症靶向免疫细胞——自然杀伤（NK）细胞，经过修饰后可以选择性靶向淋巴瘤，在该研究中使小鼠淋巴瘤显著减少。

该研究使用化学酶糖酵解编辑策略重新工程化设计了NK-92MI细胞，将一种表面分子——高亲和力和特异性的CD22配体引入其中，使其能与B细胞表面受体CD22结合，以实现肿瘤特异性CD22靶向。

为了在体内有效杀伤淋巴瘤细胞，研究人员进一步使用一种新分子——E-选择素配体Sialyl Lewis X，对CD22配体修饰的NK-92MI细胞进行功能化，以促进其向淋巴瘤细胞之间的骨髓运输，结果显示，这种双重功能化的NK细胞显著延迟了小鼠淋巴瘤的进展。

这一研究结果表明，用CD22聚糖配体和选择素修饰的NK细胞分别促进了对B淋巴瘤细胞的靶向杀伤和改善了向癌细胞驻留部位的运输。

2.调控CAR-NK细胞免疫代谢优化扩增和细胞毒性

7月7日，Molecular Therapy Methods & Clinical Development 上刊登了一篇来自美国新泽西罗格斯大学刘东方研究团队的文章，其中提出通过调控CAR-NK细胞免疫代谢可以使得各种来源的NK和CAR-NK细胞获得优于传统方法的扩增和细胞毒性。研究证明了21-mIL21扩增系统优越性：

1. 221-mIL21细胞表面特定HLA表达图谱可以“批准”CAR-NK细胞杀伤活性

2. 221-mIL21细胞表面上调的共刺激分子可以增强的CAR-NK活性及增殖

3. EBV转化的221-mIL21细胞可以促进NK活化及增殖

4. 221-mIL21细胞可以通过增强代谢，从而促进记忆性CAR-NK形成

5. 221-mIL21细胞可以降低CAR-NK“自相残杀”

3.NK细胞联合PD-1治疗复发难治霍奇金淋巴瘤

2020年11月19日，致力于恢复患者先天免疫的临床阶段德国生物技术公司Affimed在Blood杂志上公布其CD30/CD16A NK细胞engager（ICE）候选产品AFM13联合默沙东（MSD）的抗PD-1疗法Keytruda（帕博利珠单抗）治疗复发难治性霍奇金淋巴瘤的1b期临床研究最终结果，证明了该联合疗法具有良好的耐受性和疗效，最高治疗剂量下的客观缓解率（ORR）为88％，完全缓解率（CR）达到46％。

Affimed公司开发的ROCK（重定向优化细胞杀伤）技术平台能够快速发掘同时与NK/T细胞和肿瘤细胞表面抗原结合的多特异性抗体，抗体通过与NK/T细胞表面的特定抗原和肿瘤细胞表面抗原结合，成功的将NK/T细胞招募到肿瘤细胞附近，促进其杀伤作用。基于该技术平台，Affimed开创性的癌症免疫疗法是通过CD16A受体激发NK细胞的细胞毒性潜力的，目前其明星候选产品AFM13已经进入了临床II期开发。

总之，目前NK细胞临床试验大多数还处于比较早期的阶段，未来需要在现有技术的基础上，不断提高NK细胞治疗的有效性和安全性，优化生产（降低成本，缩短生产周期，优化工艺），扩大治疗范围。

以NK细胞为基础的过继性免疫治疗需要大量的细胞，其应用范围为患者每公斤体重需1×10 6 —8×10 7 CD3 - CD56 + NK细胞 (即一个80kg的成人需要至少8x10 7 NK细胞，并需多次回输)。此外，NK细胞在外周血中所占比例很低（5-15%），因此在用于过继性免疫治疗之前，有必要对其进行扩增。

NK细胞免疫治疗的细胞来源

自体或异体NK细胞用于移植，可从不同来源获得细胞：外周血单个核细胞（PBMC）、脐带血（UCB）、骨髓（BM）、诱导多能干细胞（iPSC）和细胞系。大量高纯度、高活性的NK细胞的扩增是其用于治疗的关键因素。NK细胞扩增可以纯化或富集的NK细胞抑或从单采血产品（如PBMCs）为起始材料。随后，扩增的NK细胞在最后阶段被纯化，通常是通过磁分选( CliniMACS ® systems )来消除其他免疫细胞，如T或B细胞。这在异体造血干细胞移植至关重要，供者的异基因反应性T淋巴细胞会对患者产生副作用，如GvHD。因此，安全高效的生产方法是获得大量功能性NK细胞的关键，为NK研究和临床应用做好准备。

细胞因子诱导NK细胞增殖

体外扩增NK细胞，使用细胞因子是一种有效扩增NK细胞并提高其活性的方法，因为众所周知，它们介导NK细胞的增殖和活化。大量的细胞因子如IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21和I型干扰素已被相继用于NK细胞的体外扩增。

IL-2可在短时间（24小时）内促进NK细胞的存活、激活和提高细胞毒性。IL-2刺激PBMCs可导致淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine-activated killer, LAK）数量的增加，LAK由NK细胞和T细胞组成，对自体肿瘤细胞具有较高的杀伤能力。

IL-2和IL-15联合应用可促进NK细胞的增殖和活性，有利于NK细胞的激活。且只有 IL-15可以维持NK细胞在输注患者后的细胞溶解功能。IL-2和IL-15诱导NK细胞活化受体NKG2D、NKp44、NKp30和NKp46的表达，提高其对肿瘤细胞株的细胞毒性。 IL-12也用于体外NK细胞培养，刺激NK细胞产生IFN-γ。IL-12、IL-15和IL-18联合作用可诱导细胞因子诱导的记忆样NK细胞（Cytokine-induced memory-like, CIML），是一种寿命长、细胞毒性高、分泌IFN-γ的细胞。CIML-NK细胞已在小鼠肿瘤模型中进行过继免疫治疗，并显示出抗黑色素瘤和淋巴瘤的良好效果。

辅助细胞和滋养层细胞协助NK细胞扩增

NK细胞的扩增需要多种生存、增殖和激活信号。因此，来自辅助细胞 (accessory cell)的刺激可以用来增强NK细胞的扩增，获得足够的细胞用于后续NK细胞治疗。过去文献显示，起始材料使用PBMC比使用纯化的NK细胞进行体外扩增，可获的更多数量的NK细胞，这表明PBMC中的其他非NK细胞为NK细胞的增殖提供了额外辅助。NK细胞与自体非NK细胞或生长失活的滋养细胞（如PBMC 或K562细胞系）共培养也也是一种策略，对NK细胞的活化和扩增有显著影响。尽管细胞系（ex. K562）共培养帮助NK细胞扩增取得了显著的效果，但这些用肿瘤细胞系进行扩增的方法需要建立一个主细胞库 (master cell bank)，并遵循GMP严格的规定操作，以确保其在过继免疫治疗中的安全使用。

实验步骤（仅供参考）

试剂：NK细胞培养套装；

耗材：培养瓶；细胞培养袋；移液管；采血袋等。

（nk细胞培养试剂、耗材请微信搜索“泽平科技”公众号进行咨询）

操作过程：

D0：白细胞层分离培养及诱导

脐血经病毒检测合格后，送入实验室中。取70ml脐血，按常规的血浆及PBMC分离方法分离获得血浆和白细胞层。白细胞层经洗涤，计数为7.4*107，以1.5*106个/ml密度接种在培养瓶中。加入诱导培养基、因子及灭活血浆，放置在37℃，5%CO2的二氧化碳培养箱中培养。

注意事项：

1、脐血尽可能采集新鲜血液，否则容易凝血；

2、需注意Ficoll的温度，否则易混杂较多红细胞；

3、注意离心的升降速设置，否则无法获得白细胞层。

D2：显微镜下观察细胞生长状况：

细胞经诱导刺激，有明显的半贴壁聚团生长，部分细胞聚团悬浮生长。细胞略有增殖，增殖不明显。

20*物镜

D3：细胞观察并补充诱导培养基

细胞经过培养，半悬浮贴壁较D2增多，细胞聚团更为明显。

注意事项：前3天不能剧烈晃动细胞，避免干扰细胞成团。

10*物镜

D5：细胞观察并补充增殖培养基

经过两天的培养，半悬浮贴壁的细胞已开始悬浮于培养基中，培养基颜色变黄。细胞计数为1.1*106/ml，补充增殖培养基，刺激NK细胞增殖。

10*物镜

D7：细胞观察并补充增殖培养基

培养基颜色变黄，显微镜下可明显看到细胞聚团增大。细胞计数为2.0*106/ml，补充增殖培养基，调整细胞密度，刺激NK细胞增殖。细胞转移至培养袋中培养。略微吹打细胞，使细胞团略微分散。轻晃培养袋，使细胞分散培养。

10*物镜

D9：细胞观察并补充增殖培养基

培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，发现细胞已基本分散生长。细胞计数为1.5*106/ml，补充培养基。

10*物镜

D11：细胞观察并补充增殖培养基

培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，发现细胞已呈不规则形态，部分细胞有触角伸出。细胞计数为1.7*106/ml，补充培养基。

10*物镜

40*物镜

D12：细胞观察并补充增殖培养基（本次非常规补液）

培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，细胞形态与D11基本类似，取细胞进行流式细胞检测。细胞计数为1.5*106/ml，补充培养基。

流式细胞检测：CD3-/CD16+CD56+为82.74%

10*物镜

40*物镜

D12-NK细胞流式检测结果

D14：细胞检测

培养袋中培养基变黄，取细胞计数并将细胞放置在细菌皿中观察形态，取细胞进行流式细胞检测。细胞计数为2.0*106/ml。

流式细胞检测：CD3-/CD16+CD56+为90.98%

10*物镜

40*物镜

D14-NK细胞流式检测结果

NK细胞培养扩增（细胞供应、培养基、培养装置等推荐）

培养基：

NK相关细胞因子：

细胞培养瓶、培养袋、生物反应器：

参考文献：

（1）郑荣寿，孙可欣，张思维等.2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J].中华肿瘤杂志 2019, 41(1):19-28

（2）谢思伦. 自然杀伤细胞治疗肝癌的前瞻性研究[J]. 现代肿瘤医学，2020，28（07）：1165-1169.

（3）王聪洁，杨丽丽等. NK 细胞在晚期结肠癌综合治疗中的应用研究[J].中国现代医生，2019，57（14）：72-80.

（4）王春键, 黄晓军, 宫立众, et al. 化疗联合异基因自然杀伤细胞巩固治疗低中危急性髓系白血病的疗效观察[J]. 中华血液学杂志, 2019, 40(10):812-817.

（5）苏永强. 分析NK细胞、CIK细胞及γ/δT细胞免疫治疗联合化疗治疗小细胞肺癌的临床疗效[J]. 中外医疗，2015，17（28）：59-60.

（6）Adapted from Cancer Immunol Immunother 2020 May;69(5):879-899.

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