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对参考序列构建index

$ bowtie2-build genome.fasta index

尝试使用前10000个reads进行比对

$ bowtie2 -u 10000 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam

使用8个线程进行比对

$ bowtie2 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam

比对的sam结果中添加了read group信息

$ bowtie2 -p 8 --rg-id sample01 --rg "PL:ILLUMINA" --rg "SM:sample01" -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam

常用的参数进行比对，可以更改其中的参数获得更好的结果

$ bowtie2 -q --phred33 --sensitive --end-to-end -I 0 -X 500 --fr --un unpaired --al aligned --un-conc unconc --al-conc alconc -p 6 --reorder -x {-1 | -U } -S []

用法：

bowtie2 [options]* -x {-1 -2 | -U } -S []

bowtie2-build用法

bowtie2-build默认情况下将fasta文件换成index的数据库。

$ bowtie2-build

必须参数：

-x 由bowtie2-build所生成的索引文件的前缀。首先 在当前目录搜寻，然后

在环境变量BOWTIE2_INDEXES中制定的文件夹中搜寻。

-1 双末端测寻对应的文件1。可以为多个文件，并用逗号分开；多个文件必须和-2

中制定的文件一一对应。比如:"-1 flyA_1.fq,flyB_1.fq -2 flyA_2.fq,flyB

_2.fq".测序文件中的reads的长度可以不一样。

-2 双末端测寻对应的文件2.

-U 非双末端测寻对应的文件。可以为多个文件，并用逗号分开。测序文件中的reads的

长度可以不一样。

-S 所生成的SAM格式的文件前缀。默认是输入到标准输出。

以下是可选参数：

输入参数

-q输入的文件为FASTQ格式文件，此项为默认值。

-qseq输入的文件为QSEQ格式文件。

-f输入的文件为FASTA格式文件。选择此项时，表示--ignore-quals也被选择了。

-r输入的文件中，每一行代表一条序列，没有序列名和测序质量等。选择此项时，表示--

ignore-quals也被选择了。

-c后直接为比对的reads序列，而不是包含序列的文件名。序列间用逗号隔开。选择此项时，

表示—ignore-quals也被选择了。

-s/--skip input的reads中，跳过前个reads或者pairs。

-u/--qupto 只比对前个reads或者pairs(在跳过前个reads或者

pairs后)。Default: no limit.

-5/--trim5 剪掉5'端长度的碱基，再用于比对。(default: 0).

-3/--trim3 剪掉3'端长度的碱基，再用于比对。(default: 0).

--phred33输入的碱基质量等于ASCII码值加上33.在最近的illumina pipiline中

得以运用。最低碱基质量是“#”。

--phred64输入的碱基质量等于ASCII码值加上64.最低碱基质量是“B”。

--solexa-quals将Solexa的碱基质量转换为Phred。在老的GA Pipeline版本中得以

运用。Default: off.

--int-quals输入文件中的碱基质量为用“ ”分隔的数值，而不是ASCII码。比如40 40

30 40...。Default: off.

–end-to-end模式下的预设参数

--very-fastSame as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50

--fast Same as:-D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50

--sensitiveSame as:-D 15 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.15(default in --end-to-endmode)

--very-sensitive Same as:-D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50

–loca模式下的预设参数

--very-fast-localSame as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00

--fast-local Same as:-D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75

--sensitive-local Same as:-D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75(default in --local mode)

--very-sensitive-local Same as:-D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50

比对参数：

-N 进行种子比对时允许的mismatch数.可以设为0或者1.Default: 0.

-L 设定种子的长度.

************************************************************

功能选项

给bowtie的一些参数设定值的时候，使用一个计算公式代替，于是值的大小与比对序列的长

度成一定关系。有三部分组成: (a)计算方法,包括常数(C),线性(L),平方根(S)和

自然对数(G); (b)一个常数; (c)一个系数.

例如:

为L,-0.4,-0.6则计算公式为: f(x) = -0.4 + -0.6 * x

为G,1,5.4则计算公式为: f(x) = 1.0 + 5.4 * ln(x)

************************************************************

-i 设定两个相邻种子间所间距的碱基数。

************************************************************

例如：如果read的长度为30,种子的长度为10,相邻种子的间距为6,则提取出的种子如下

所示：

Read:      TAGCTACGCTCTACGCTATCATGCATAAAC

Seed 1 fw: TAGCTACGCT

Seed 1 rc: AGCGTAGCTA

Seed 2 fw:       CGCTCTACGC

Seed 2 rc:       GCGTAGAGCG

Seed 3 fw:             ACGCTATCAT

Seed 3 rc:             ATGATAGCGT

Seed 4 fw:                   TCATGCATAA

Seed 4 rc:                   TTATGCATGA

************************************************************

在--end-to-end模式中默认值为”-i S,1,1.15”.即表示f(x) = 1 + 1.15 *

sqrt(x).如果read长度为100,则相邻种子的间距为12.

--n-ceil 设定read中允许含有不确定碱基(非GTAC,通常为N)的最大数目.

Default: L,0,0.15.计算公式为: f(x) = 0 + 0.15 * x,表示长度为100的read

最多运行存在15个不确定碱基.一旦不确定碱基数超过15,则该条read会被过滤掉.

--dpad Default: 15.

--gbar 在read头尾个碱基内不允许gap. Default: 4.

--ignore-quals计算错配罚分的时候不考虑碱基质量.当输入序列的模式为-f, -r或

者-c的时候,该设置自动成为默认设置.

--nofw/--norc –nofw设定read不和前导链(forward reference strand)进行比对;

--norc设定不和后随链(reverse-complement reference strand)进行比对.

Default: both strands enabled.

--end-to-end比对是将整个read和参考序列进行比对.该模式--ma的值为0.该模式为

默认模式, --local模式冲突.

--local该模式下对read进行局部比对,从而, read两端的一些碱基不比对，从而使比

对得分满足要求.该模式下 –ma默认为2.

得分罚分参数

--ma 设定匹配得分. --local模式下每个read上碱基和参考序列上碱基匹配,则

加分.在—end-to-end模式中无效. Default: 2.

--mp MX,MN设定错配罚分.其中MX为所罚最高分, MN为所罚最低分.默认设置下罚分与

碱基质量相关.罚分遵循的公式为: MN + floor( (MX-MN)(MIN(Q, 40.0)/40.0) ).

其中Q为碱基的质量值.如果设置了—ignore-qual参数,则错配总是罚最高分. Default:

MX = 6, MN = 2.

--np 当匹配位点中read, reference上有不确定碱基(比如N)时所设定的罚分值.

Default: 1.

--rdg ,设置在read上打开gap罚分,延长gap罚分.

Default: 5, 3.

--rfg ,设置在reference上打开gap罚分,延长gap罚分

. Default: 5, 3.

--score-min 设定成为有效比对的最小分值.在—end-to-end模式下默认值为:

L,-0.6,-0.6;在--local模式下默认值为: G,20,8.

报告参数

-k 默认设置下, bowtie2搜索出了一个read不同的比对结果,并报告其中最好的

比对结果(如果好几个最好的比对结果得分一致,则随机挑选出其中一个).而在该模式下,

bowtie2最多搜索出一个read 个比对结果,并将这些结果按得分降序报告出来.

-a和-k参数一样,不过不限制搜索的结果数目.并将所有的比对结果都按降序报告出来.

此参数和-k参数冲突.值得注意的是:如果基因组含有很多重复序列时,该参数会导致程序

运行极其缓慢.

Effort 参数

-D 比对时,将一个种子延长后得到比对结果,如果不产生更好的或次好的比对结果,

则该次比对失败.当失败次数连续达到次后,则该条read比对结束. Bowtie2才会

继续进行下去. Default: 15.当具有-k或-a参数,则该参数所产生的限制会自动调整.

-R 如果一个read所生成的种子在参考序列上匹配位点过多.当每个种子平均匹配超

过300个位置,则通过一个不同的偏移来重新生成种子进行比对. 则是重新生成种子

的次数. Default: 2.

Paired-end 参数

-I/--minins 设定最小的插入片段长度. Default: 0.

-X/--maxins 设定最长的插入片段长度. Default: 500.

--fr/--rf/--ff设定上下游reads和前导链paired-end比对的方向. --fr:匹配时，

read1在5'端上游,和前导链一致, read2在3'下游,和前导链反向互补.或者read2在

上游, read1在下游反向互补; --rf: read1在5'端上游,和前导链反向互补, read2在

3'端下游,和前导链一致; --ff:两条reads都和前导链一致. Default: --fr.默认

设置适合于Illumina的paired-end测序数据;若是mate-paired,则要选择—rf参数.

--no-mixed默认设置下,一对reads不能成对比对到参考序列上,则单独对每个read进

行比对.该选项则阻止此行为.

--no-discordant默认设置下,一对reads不能和谐比对(concordant alignment,

即满足-I, -X, --fr/--rf/--ff的条件)到参考序列上,则搜寻其不和谐比对(discon

cordant alignment,即两条reads都能独一无二地比对到参考序列上,但是不满足-I,

-X,--fr/--rf/--ff的条件).该选项阻止此行为.

--dovetail read1和read2的关系为dovetail的时候,该状况算为和谐比对.默认情况

下dovetail不算和谐比对.

--no-contain read1和read2的关系为包含的时候,该状况不算为和谐比对.默认情况

下包含关系算为和谐比对.

--no-overlap read1和read2的关系为有重叠的时候,该状况不算为和谐比对.默认情

况下两个reads重叠算为和谐比对.

输出参数

-t/--time --un 将unpaired reads写入到.

--un-gz 将unpaired reads写入到, gzip压缩.

--un-bz2 将unpaired reads写入到, bz2压缩.

--al 将至少能比对1次以上的unpaired reads写入.

--al-gz ... ,gzip压缩.

--al-bz2 ... ,bz2压缩.

--un-conc 将不能和谐比对的paired-end reads写入.

--un-conc-gz ... ,gzip压缩.

--un-conc-bz2 ... ,bz2压缩.

--al-conc 将至少能和谐比对一次以上的paired-end reads写入.

--al-conc-gz ... ,gzip压缩.

--al-conc-bz2 ... ,bz2压缩.

--quiet安静模式,除了比对错误和一些严重的错误,不在屏幕上输出任何东西.

--met-file 将bowtie2的检测信息(metrics)写入文件.用于debug.

Default: metrics disabled.

--met-stderr 将bowtie2的检测信息(metrics)写入标准错误文件句柄.和上

一个选项不冲突. Default: metrics disabled.

--met 每隔秒写入一次metrics记录. Default: 1.

Sam 参数

--no-unal不记录没比对上的reads.

--no-hd不记录SAM header lines (以@开头).

--no-sq不记录@SQ的SAM header lines.

--rg-id 设定read group ID为text。在SAM文件的头中增加一行@RG，在输出的SAM

文件中添加Tag "RG:Z:text"。

--rg 使用text作为@RG的一列，比如"SM:Pool1"。在@RG中加入多列，则多次使用

该参数即可。在进行Variant calling的过程中需要@RG头，SM信息和Tag RG。

性能参数

-o/--offrate 无视index的offrate值,以取代之. Index默认的

值为5. 值必须大于index的offrate值,同时越大,耗时越长，耗内存越少.

-p/--threads NTHREADS设置线程数. Default: 1

--reorder多线程运算时,比对结果在顺序上会和文件中reads的顺序不一致,使用该选

项,则使其一致.

--mm使用内存定位的I/O来载入index,而不是常规的文件I/O.从而使多个bowtie程

序共用内存中同样的index,节约内存消耗.

其它参数：

--qc-filter滤除QSEQ fileter filed为非0的reads.仅当有—qseq选项时有效.

Default: off.

--seed 使用作为随机数产生的种子. Default: 0.

--version打印程序版本并退出

-h/--help打印用法信息并推出