标题：细菌性脲酶引起克罗恩病患者的肠道菌群失调

导读

肠道菌群组成受到很多环境因素（内外环境）的影响，如饮食、抗生素使用、肠道炎症及致病菌的侵入等；术语’dysbiosis’指的是与宿主疾病状态相关的微生物组成发生改变，也叫肠道菌群失调；一个患有IBD (溃疡性结肠炎或者克罗恩病)的病人的肠道菌群特征通常是变形菌门的菌丰度普遍更高。
尽管肠道炎症可以导致肠道菌群组成发生改变，但是反过来肠道菌群的改变也会影响肠道炎症。变形菌门通常认为是一种致病菌，并且已经发现某些来自于变形菌门下的细菌与IBD动物模型的肠道炎症相关。另外厚壁菌门的减少（主要为梭状芽胞杆菌Clostridia），通常会导致短链脂肪酸SCFAs的减少，而SCFAs可以提高调节性T细胞水平从而使肠粘膜获得免疫耐受。
迄今为止，与疾病相关的肠道菌群失调背后的生物学机制还没有完全阐述清楚。来源于兼性厌氧菌的的次级代谢产物引起了科研工作者的一些假设，比如与肠道炎症相关的肠道中氧化还原电位的改变导致生态失调。另一种假设是炎症可能导致宿主产生小分子，如硝酸盐，它们可以作为促进无氧呼吸的电子受体。

文献简介

原标题：A role for bacterial urease in gut dysbiosis and Crohn’s disease
译名：细菌性脲酶引起克罗恩病患者的肠道菌群失调
期刊：SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE
IF: 16.710
通讯作者：Gary D. Wu
研究领域：「Diet, the Gut Microbiome, and Host Metabolism」
通讯地址：Division of Gastroenterology, Hospital of the University of Pennsylvania & childhood obesity research at The Children’s Hospital of Philadelphia

摘要

背景：炎症性肠病相关的肠道生态失调主要指的是与宿主肠道炎症相关的肠道微生物组成发生了剧烈的改变；
技术手段：宏基因组鸟枪法测序和非靶向代谢组学；
结果：发现疾病严重程度，肠道菌群失调和游离氨基酸之间具有相关性；在小鼠中使用15N标记的氮流研究表明，细菌脲酶可以水解宿主尿素，释放出的氨可以被肠道菌群利用，用于氨基酸的合成。将认为设计的一种表达脲酶的共生大肠杆菌定殖于小鼠体内，发现可以引起小鼠的肠道菌群失调，具体表现为变形菌门物种的增加；
结论：脲酶的表达与氮流与肠道菌群紊乱的相关性结果表明细菌脲酶可能是炎症性肠病的潜在治疗靶标。

实验设计

结合宏基因组meta测序获得菌群组成数据和不同质谱方法获得粪便代谢物组成，前期结合统计学方法得到与肠道菌群失调相关的粪便氨基酸；后期通过同位素标记追踪氮流的方法，并结合细菌培养，小鼠疾病模型和构建表达脲酶的大肠杆菌，多方面开展生物学研究来探索脲酶介导的氨基酸氮流的改变是否是引起肠道菌群失调及肠道炎症的原因。

研究结果

1. 克罗恩病患者粪便氨基酸与疾病相关

该研究所用到的群体为Pediatric Longitudinal Study of Elemental Diet and Stool Microbiome Composition (PLEASE) study。该群体通过宏基因组meta测序分析发现克罗恩患病个体与健康个体的基因功能通路存在显著差异，随机森林分析发现sulfur relay systems，氮代谢和氨基酸合成通路在患病个体中显著富集。本文中作者通过非靶向粪便代谢组学鉴定了341个代谢物，大部分代谢物注释为氨基酸以及氨基酸衍生物，并且和疾病显著相关（Fig. 1A）。这些代谢物还通过定量高效液相色谱确认。

粪便样品中钙卫蛋白的水平可以反映肠道炎症程度，而且与粪便中的氨基酸是呈一个显著相关的关系。为了确定菌群是否会影响氨基酸及其衍生物的水平，发现经抗生素处理的患者中粪便钙卫蛋白和氨基酸正相关的结果减少了，那么表明克罗恩病患者粪便中氨基酸的增加部分可能是由菌群贡献的。

2. 粪便氨基酸与克罗恩病患者肠道中的变形菌门呈正相关

在小儿克罗恩病患者中发现很多氨基酸及其衍生物与肠道菌群失调，基因改变呈正相关。进一步分析发现与变形菌门物种呈正相关(Fig. 2)。变形菌门分类下的细菌已知和IBD患者的肠道菌群紊乱相关，并且和结肠炎的恶化发生。这些发现与我们先前报道的克罗恩病患者中的菌群失调，氮流富集和合成氨基酸的细菌基因之间呈正相关的结果一致。

3. 细菌脲酶促进氮流合成氨基酸

肠道微生物对氮流起着重要的作用。细菌性脲酶将结肠中来源于宿主的尿素水解成氨，随后被宿主吸收或被微生物用作氮源。为了研究细菌性脲酶在微生物氨基酸合成中的作用，我们向3组小鼠分别灌喂了同位素15N2标记的尿素：1）第一组小鼠是空白对照组；2）第二组通过抗生素和PEG（polyethylene glycol，聚乙二醇）清除肠道微生物；3）第三组小鼠用ABX / PEG处理，然后接种一种改进过的琼脂菌群（ASF），这是一种由八种鼠共生细菌组成的联合体，具有最小的脲酶基因含量，并且通过16S rRNA标记基因测序确定其成功定植在组3小鼠肠道内(Fig. 3A)。

收集粪便颗粒并使用液/气相色谱-质谱法测定粪便样品中氨基酸化合物中15N的原子百分比。考虑到细菌性脲酶是[15N2]尿素水解成15NH3所必须的，赖氨酸不经过宿主利用的15NH3进行转氨作用，所以小鼠粪便中检测到的[15N]标记的赖氨酸可能仅由细菌合成。相比于用常规饲养的对照小鼠，ASF接种的小鼠中的粪便[15N]赖氨酸显著更低（P <0.05）（Fig. 3B）。接种ASF小鼠中粪便[15N]赖氨酸含量与ABX / PEG处理的小鼠相近，由此证明脲酶在肠道微生物氨基酸合成的氮流中的重要性。

4. 通过减少肠道细菌的负荷促进定植小鼠建立新的稳态

在定植外源菌之前，需要先通过结合抗生素和PEG来减少肠道内源菌的负荷，也是确保定植成功的重要条件。并且作者发现抗生素和PEG的结合是效果最好的（Fig. 4A）。另外，作者发现通过对5个成年人给予三种抗生素（利福昔明，甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑，甲硝哒唑）对肠道菌群组成的作用不大，反而是个体间的差异更大（Fig. 4B and 4C）。但是另外一种通过饲喂抗生素后又补充PEG则显著降低菌群的组成。

5. 细菌性脲酶改变了定植小鼠肠道菌群的组成

作者猜测细菌脲酶可能会影响经过ABX/PEG处理的小鼠的肠道菌群。上面提及过，克罗恩病患者肠道菌群的失调与细菌氮代谢基因的表达相关。另外，还观察到克罗病的严重程度，粪便中氨基酸的含量以及与生态失调相关的细菌分类之间呈现正相关。从而猜测尿酸酶可以导致肠道菌群的失调。作者假设通过将小鼠肠道中清除细菌后并定植经过人工改造的可以表达脲酶的大肠杆菌，发现可以引起肠道菌群组成的改变。为了验证这个猜想，作者设计了一个鼠共生大肠杆菌MP1，将奇异变形杆菌的脲酶操纵子基因插入到大肠杆菌MP1中。利用的是一个可诱导的，可在大肠杆菌中发挥功能的脲酶基因簇并且通过克里斯滕森尿素琼脂板进行脲酶活力的验证(Fig. 5A)。于是，野生型鼠大肠杆菌MP1菌株命名为Ure-，导入了尿酸酶基因的大肠杆菌MP1命名为Ure+，将这两种菌连续注入ABX/PEG处理过的小鼠中。ABX/PEG清除肠道内源菌的方法比先前报道的方法使Ure-和Ure+成功定植在小鼠的细菌数目高达1000倍(Fig. 5B and 5C)。

成功移植的大肠杆菌MP1导致小鼠肠道菌群的变化依赖于脲酶而不是笼子效应。作者通过5个干预实验得到验证：

1）ABX/PEG；

2）ABX/PEG followed by inoculation with the feces of conventionally housed mice；

3）ABX/PEG followed by inoculation with Ure−MP1；

4）ABX/PEG followed by inoculation with Ure+ MP1；

5）ABX/PEG followed by inoculation with a 1:1 mixture of Ure− and Ure+ MP1

虽然5组小鼠起始时的肠道菌群组成是相近的，但是定植29天后通过16S rRNA基因测序分析发现5组小鼠肠道菌群组成差异很大(Fig. 5D)。通过比较第0天和第29天发现不同笼子之间的差异是由不同处理的肠道菌群组成差异造成的(Fig. 5E)，说明这些差异是不依赖于笼子效应的。

6. 细菌脲酶影响了肠道菌群组成以及使动物模型的结肠炎恶化

定植了Ure-大肠杆菌和Ure+大肠杆菌小鼠的肠道菌群组成见图(Fig. 5F)。定植了Ure-大肠杆菌的小鼠肠道微生物群落组成主要为厚壁菌门，包括梭菌目，瘤胃球菌属、Dorea，颤螺菌属，消化链球菌属及梭菌科。这些细菌都被报道与宿主健康相关。相反的是，定植了Ure+小鼠肠道微生物组成中变形菌门的丰度显著更高，包括肠杆菌科和鞘脂单胞菌科，且报道与肠道菌群紊乱相关。由此可见，通过移植插入单个编码细菌脲酶的操纵子基因的细菌就能够有效的将定植小鼠肠道菌群发生紊乱。

T细胞转移实验一个月后发现，移植了Ure+大肠杆菌的小鼠体重开始下降。44天后，体重下降了20%(Fig. 6B)。相反的是，盲肠和结肠的重量在增加，然后盲肠的长度比接种了Ure-大肠杆菌的小鼠更短(Fig. 6C)，同时具有较高的结肠炎炎症指标(Fig. 6C)，这些结果表明接种了Ure+大肠杆菌的小鼠结肠炎恶化，组织病理学切片验证了该结果(Fig. 6D)。与前面的研究结果一致，即在肠道菌群失调的克罗恩病患者中粪便氨基酸含量更高，同时发现在接种了Ure+ MP1结肠炎小鼠模型与接受Ure-MP1的小鼠相比，粪便氨基酸的数量也更高。这些结果表明通过接种人为设计的能够表达脲酶的共生大肠杆菌可以导致免疫介导的IBD小鼠模型肠道菌群发生紊乱。

总结

如果肠道菌群失调是引起疾病原因，那么对紊乱的肠道菌群进行干预使其恢复正常水平则是一种潜在的治疗方案。在这里，作者首次报道了脲酶介导的氮被肠道菌群利用可能对IBD患者肠道菌群的紊乱的发生发挥了重要的作用。并且，通过向小鼠模型中移植人为设计的能够表达脲酶的单一大肠杆菌可以加剧结肠炎的发生。

不足之处

1. 虽然结果发现了粪便中的氨基酸与IBD患者和结肠炎小鼠模型相关，但是通过现有的技术手段还不清楚这些氨基酸宿主提供了多少，肠道菌群又贡献了多少。

2. 文章中的小鼠没有提供关于是哪种细菌脲酶诱导肠道菌群紊乱的机制信息。

意义

1. 本文确实揭示了来自于细菌脲酶代谢生成的氮的流通在肠道失调和IBD的发病机理中的作用。

2. 可以靶向肠道菌群来治疗人类疾病

注：以上观点均编译自文献，具体内容见后面链接！

参考文献链接

[1] 原文链接：http://stm.sciencemag.org/content/9/416/eaah6888

[2] 姊妹篇：Inflammation, Antibiotics, and Diet as Environmental Stressors of the Gut Microbiome in Pediatric Crohn’s Disease
[3]点击查看上一篇文献

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