PNAS | 土壤氮循环微生物功能特征的全球生物地理学

1 摘要

微生物驱动了地球氮循环的大部分，但我们仍然缺乏对执行土壤氮过程的微生物丰度和组成的全球概览。为了解决这一研究差距，我们利用公开可用的土壤宏基因组数据，对微生物氮功能特征的生物地理学进行了描述，定义为八种氮循环途径。生境类型、土壤碳、氮在很大程度上解释了样本的总氮途径相对丰度。相比之下，我们不能确定的驱动氮循环功能基因的物种分类组成。此外，含有某种氮代谢途径的优势属在不同生境类型中的分布普遍相似。在土壤生境发现了一个意料之外的高相对丰度的由细菌携带的途径，异化异硝酸盐还原，其是土壤中一个很少研究的氮循环过程。最后，系统发育分析表明，一些微生物类群似乎是氮循环的specialists（专一）或generalists（广泛）。例如，Deltproteobacteria具有所有的8 种氮循环途径，而蓝细菌主要编码3种氮循环途径。总的来说，这种基于性状的方法为研究全球土壤中微生物多样性和氮循环之间的关系提供了基础。

关键词 硝化作用|固氮|氨同化|宏基因组|异化亚硝酸盐还原

2 研究背景

本世纪的一个重大挑战是预测环境变化将如何改变全球生物地球化学循环。生物地理学在这一努力中扮演着重要的角色。环境变化正在改变生物多样性的分布，而生物多样性的分布又是生物地球化学过程的关键驱动因素。从历史上看，生物地理学通过分类学的视角来看待生物多样性，主要解决物种分布问题。然而，关注特性——尤其是那些涉及生态系统过程的特性——可能提供生物多样性模式和生物地球化学之间更清晰的联系。

这些概念尤其与微生物有关。微生物催化主要元素的生物地球化学循环,因为他们的绝对丰度占有大量的元素物质。此外,像植物和动物一样,微生物分类组成在空间的变化可以影响生态系统过程。因此，考虑到微生物的特性，应该努力将生物地理模式和生态系统过程联系起来。

在这里，我们首次描述了土壤中微生物氮循环特征的全球生物地理模式。微生物通过与大气交换(固氮和反硝化作用)和硝态氮淋失来调节生物有效氮。它们还影响植物吸收可利用氮的形式。与此同时，人类活动通过增加生物圈中活性氮，已经并将继续改变氮循环。在局部尺度上，氮的添加会不断改变土壤和其他生态系统中的微生物组成。因此，微生物性状的分布与当前和未来的氮循环有关。

图1. 收集宏基因组数据的全球地理位置

3 主要结果

利用宏基因组学分析服务器(MG-RAST)检索表层土壤的宏基因组数据。在对样本进行序列和数据质量的整理之后，最终获得了365个样本，其中代表了来自10种不同栖息地类型（Habitat type）的118个独特地理位置，覆盖了自然和人为主导的系统(图1）。不同样本的测序深度差异很大，但没有明显偏向于任何特定的栖息地类型(图S1)。为了标准化测序深度，我们分析每N个通路在样本中的相对丰度。无论将通路相对丰度归一化为每个注释序列或每个标记基因检测到的数量(基于30个保守的单克隆基因)，观察到的趋势都是相似的(图S1)。细菌在宏基因组文库中占主导地位，占全部序列的95%，其次是真菌占3%，古菌仅占2%。已知真菌序列在宏基因组文库中的比例低于它们对土壤微生物生物量的贡献(10)。因此，我们集中分析细菌和古菌，只分析真菌的一般趋势。例如，细菌、古菌和真菌总序列的比例在不同生境类型中存在差异(g独立性检验;P<0.001)(图S2)。按栖息地划分，古生菌占所有序列的0.9-11%，在沙漠中发现的比例最高。真菌与细菌序列的比率在温带森林土壤中特别高，正如之前观察到的(28)。

3.1 土壤氮代谢途径的相对丰度。

在土壤样本中，有0.5%的注释序列与8个N通路中的其中一个相关(图2A)，其中细菌和古菌的每个标记基因平均分别与3.3和4.7个N通路相关。单个通路的相对丰度以几个数量级变化(单因素方差分析P<0.001;F=74.21,df=7)(图2B)。细菌和古菌在N代谢的相对丰度上表现出相似的趋势，除了在古菌中没有亚硝酸盐向铵的异化还原途径。真菌序列只与同化途径有关，包括氨同化、硝酸盐同化、亚硝酸盐同化和亚硝酸盐同化氨。在不同域（domain)中，最常见的途径是氨同化(图2B)。例如，在细菌中，每100万条注释的细菌序列平均检测到280条氨同化途径。相比之下，硝化作用和N固定是最不常见的途径，每百万序列分别检测到6.1次和4.6次。值得注意的是，相对未研究的亚硝酸还原氨途径比这两种途径略常见，平均每百万序列检测9.3次。在所有的土壤样品中，细菌和古菌的N代谢相对丰度绝大多数都是正相关的(图3 A和B)。在细菌和古菌中，反硝化作用与硝酸盐对亚硝酸盐异化还原高度正相关(R2=0.860.97,P≤0.001)。这种关系是可以预料的，因为硝酸还原成亚硝酸盐是完全反硝化过程的第一步;然而，这里我们将这两个步骤分开，因为硝酸还原为亚硝酸也是DNRA的第一步。同样，我们将DNRA分为两种途径:异硝酸还原成亚硝酸盐和异硝酸还原成铵(图2A)。在细菌中，亚硝酸盐对铵途径的同化与其他途径呈负相关。同样，细菌和古菌中氨同化途径的相对丰度与其他N代谢均呈负相关。N固定途径一般与其他途径的相关性较弱或无相关性。

图2a 氮循环代谢的八种途径

3.2 N代谢路径的驱动者。

所有氮循环代谢的相对丰度(在所有途径上的总和)在土壤样品中差异很大，初步分析揭示了广泛的生物地理模式。平均而言，在热带森林和以人为主导(牧场、草坪和农田)的土壤中检测到了最高相对丰度，而在寒冷的沙漠中观察到的相对丰度最低(图S3)。N通路总相对丰度也随着纬度的增加呈下降趋势(R2=0.22,P<0.05);图S4)。为了解开这些模式背后的驱动因素，我们进行了多变量回归分析，包括已知的影响微生物丰度和组成的栖息地类型和环境参数。大多数样品没有当地的测量数据;相反，我们从辅助来源估计了这些变量。对于细菌而言，回归模型解释了总N代谢相对丰度中很大比例的可变性(R2=0.58,P<0.001）。栖息地类型对该模型的贡献最大，无论是直接(与总氮途径正相关)还是与土壤碳和N的相互作用。古菌回归模型解释总氮途径相对丰度的变异性低于细菌(R2=0.43,P<0.001)。碳和氮的交互作用对模型的贡献最大，而生境仅通过与温度的交互作用而重要。

图2b 氮循环代谢途径的相对丰度

接下来我们分析了单个N通路相对丰度的驱动因素。由于各通道之间的高协方差(图3 A和B)，我们对每个通道的全相对丰度校正残差拟合回归模型。这些模型解释这一额外变异的能力差异很大(表1)。例如，N固定途径模型分别解释了细菌和古菌样本之间80%和63%的变异(P< 0.001)。相比之下，相同的参数不能解释细菌中亚硝酸盐向铵化途径的差异相对丰度。在重要模式中，生境类型是单个路径相对丰度的重要预测因子(表1)。生境还与降水、温度、土壤氮等其他因素相互作用，影响某些路径的相对丰度。例如，在沙漠中反硝化相对丰度随温度升高而升高，而在热带森林中随温度升高而降低。同样，温带森林氨同化相对丰度随土壤氮增加而增加，热带森林氨同化相对丰度随土壤氮减少。土壤碳似乎是总氮途径相对丰度的主要驱动因素，但不能解释细菌中单个途径相对丰度的差异。在这些模型中包括N沉降的估计数只改善了反硝化模型;反硝化相对丰度随氮沉降量的增加而增加。古菌中单个通路相对丰度的模型通常比细菌的模型解释的变异更少，可能是由于每个样本的序列较少。然而，对于重要的模型来说，单个N通路通常可以用与细菌相同的参数来最好地解释。以生境类型和温度为主要指标。这两个区域内N固定相对丰度的重要预测因子。同样，生境、降水生境和温度生境也导致了古菌和细菌中硝酸盐对亚硝酸盐同化相对丰度的变化。

图3 氮循环代谢途径之间的相关性

3.3 N代谢途径的微生物物种组成和系统发育分布

我们发现多种多样的微生物，包括402细菌和53古菌属（Genera)，具有N代谢基因。我们首先研究了同一属（Genera)内通路的相关性(图4和图S5)。我们检测到的10个以上序列的所有属（Genera)均具有氨同化途径。携带反硝化基因的属（Genera)通常也携带前半段反硝化途径基因，将硝酸盐异化为亚硝酸盐。一些属同时包含所有三个途径。事实上，反硝化作用和DNRA最近被证明在同一细菌中存在并发挥作用。我们还检测了只携带异化亚硝酸盐到铵途径(除了氨同化)的属。

更确切地说，土壤属和它们所属的门，在它们的氮代谢路径专一化程度上是不同的。蓝藻属似乎是专一性代谢，主要携带同化亚硝酸盐到铵和氮固定途径。相比之下，Delta变形细菌似乎为广泛性代谢，拥有多达6种途径(除了氨同化)。土壤中N固定途径在古菌和细菌中广泛分布(图4和图S5)。变形菌门中发现了丰度最高的固氮微生物，而绿菌门、厚壁菌门和蓝藻门中明显例外(图5A)。大部分序列与N固定属密切相关，可能是缓生根瘤菌和伯克霍德氏菌。其他丰富的属较少被预料到。例如，Azoarcus是一种能降解土壤污染物能力的微生物，而果胶杆菌属(Pectobacterium)主要被认为是一种植物病原菌。事实上,尽管果胶杆菌属编码一组N固定基因，尚不清楚它们是否发挥功能。其次，编码异化亚硝酸盐还原为铵的途径在土壤细菌中也广泛分布(图4)。然而，优势土壤类群局限于两个门，Deltaproteobacteria和Verrucomicrobia(图5B)。已知土壤中有大量的Verrucomicrobia，但它们的生态作用尚不清楚(37,38)。该途径中最丰富的属，Anaeromyxobacter，在农业土壤中很常见，其最近被证明可以进行一种之前未被发现的将N2O还原为N2的非反硝化过程。图S6分析了在土壤样品中编码其他6个N代谢的属的相对丰度。

图4 土壤宏基因组中氮循环物种的进化关系

3.4 N代谢途径对微生物物种组成的驱动

同样的环境因子可以很好地解释N代谢的总体相对丰度，但却不能很好地解释编码这些途径的微生物的分类学组成的变化。对于8种途径，这一模型仅解释了单一N代谢变化的7-19%。然而，就途径相对丰度而言，生境类型是组成的最佳预测因子，解释了高达14%的同化亚硝酸盐到铵途径的组成变化。温度也解释了11%的硝化途径组分变化。所有其他预测因子，包括pH值，最多能解释3%的任何途径的变异。

对两种途径的进一步研究证实了栖息地之间微弱的组成差异。携带N固定途径的15个最丰富的属在所有生境中都同样丰富，除了在寒冷的沙漠中(图5A)。编码亚硝酸盐向铵化途径的最丰富的属在不同生境中表现出更大的变异性，但其中只有一个绿菌属(Chlorobium)似乎在湿地上具有特异性(图5B)。

图5 编码特定代谢途径的物种分布

4 参考文献

Nelson, Michaeline B.; Martiny, Adam C.; Martiny, Jennifer B. H. (2016). Global biogeography of microbial nitrogen-cycling traits in soil. Proceedings of the National Academy of Sciences, 113(29), 8033–8040. doi:10.1073/pnas.1601070113

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